Den metod som presenteras här beskriver en skalbar och god tillverkningssed (GMP) -färdig differentiering system för att generera humana hepatocyt-liknande celler från pluripotenta stamceller. Den fungerar som en kostnadseffektiv och standardiserat system för att generera humana hepatocyt-liknande celler för grundforskning och tillämpad humanlever forskning.
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har stort värde för biomedicinsk forskning. hPSCs kan skalas och differentieras till alla celltyper som finns i människokroppen. Differentieringen av hPSCs till humana hepatocyt-liknande celler (HLCs) har studerats ingående, och effektiva differentieringsprotokoll har upprättats. Kombinationen av extracellulär matris och biologiska stimuli, inklusive tillväxtfaktorer, cytokiner, och små molekyler, har gjort det möjligt att generera HLCs som liknar primära mänskliga hepatocyter. Men de flesta av förfarandena fortfarande använder odefinierade komponenter, vilket ger upphov till sats till sats variationer. Detta fungerar som ett betydande hinder för tillämpning av tekniken. Att ta itu med detta problem har vi utvecklat ett utarbetat system för hepatocyte differentiering med användning av humana rekombinanta lamininer som extracellulära matriser i kombination med ett serumfritt differentieringsprocess. Högeffektiv hepatocyte specifikation uppnåddes med demonstrated förbättringar i både HLC funktion och fenotyp. Viktigare, är lätt att skala upp med hjälp av forskning och GMP-grade hPSC linjer lovande framsteg inom cellbaserad modellering och terapier detta system.
Primära mänskliga vävnader och derivatcelltyper används regelbundet, både för cellbaserad screening och i kliniken. Dock är tillgång till dessa celler starkt begränsad på grund av otillräcklig organdonation och förlust av cell fenotyper efter isolering ett. hPSCs utgör ett lovande alternativ till primär vävnad och underlätta bildandet av genetiskt definierade och förnybara humana somatiska celler. Hepatocyte-liknande celler (HLCs) härledda från hPSCs har redan visat lovande resultat i detta område. HLCs likna primära mänskliga hepatocyter i olika aspekter, inklusive cellmorfologi, hepatocyte genuttryck, metabolisk funktion och känslighet för läkemedel och virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dessutom den obegränsade proliferation ochsjälvförnyelse kapacitet både forsknings- och GMP-kvalitet hPSCs underlättar deras tillämpning 9, 10.
Över ett decennium av forskning har producerat ett antal effektiv hepatocyt differentiering förfaranden 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Men de flesta av dessa system använder odefinierade komponenter och / eller viral transduktion för att driva hepatocellulär specifikation. För att förbättra tillförlitligheten i tekniken i stor skala, är det viktigt att utveckla en robust hepatocyte differentieringsystem som verkligen är definierad, xeno-fri, och GMP-kompatibla.
Lamininer (LNS) är viktiga extracellulära matrisproteiner som kan påverka celladhesion, tillväxt, migration och differentiering. Lamininer är heterotrimera glykoproteiner som består av en α, β en och en γ kedja. På senare tid har rekombinanta humana lamininer tagits fram och används i cellbiologi. LN-511 har visat att stödja upprätthållandet av hPSCs 21, medan en blandning av LN-521 och E-cadherin kan klon härledning och utbyggnad av stamceller från mänskliga embryon 22. LN-111, å andra sidan, stöder upprätthållandet av hepatoblast liknande celler härledda från hPSCs 23. Men innan vår rapport, lamininer 521 och 111 hade inte använts för att generera HLCs med mogna egenskaper från hPSCs 10.
Här, vi detalj förfaranden för odling hPSCs på LN-521och differentiera dem antingen LN-521 eller en blandning av LN-521 och LN-111 (LN-521 / LN-111). Vi optimerat differentieringsprotokoll med användning av single-cellsådd för att generera en mycket reproducerbar och homogen monoskikt av HLCs i många format 14. Vi anser att vår definierade differentieringssystem utgör en enkel och kostnadseffektiv metod för att tillverka aktiva HLCs för applicering, vilket innebär en betydande steg framåt när det gäller.
Att främja mänskliga pluripotenta stamceller och translationell medicin, Xeno fria system som uppfyller gällande riktlinjer för god tillverkningssed krävs. Nyckeln till alla differentieringsprocess är den extracellulära matrisen (ECM). ECM inte bara stödjer cellvidhäftning, men ger också tillgång till signalnyckelfaktorer, som påverkar cellbestämning och fenotyp 25, 26.
Lamininer är multifunktionella extracellulära matrixproteiner in vivo. I levern, är avgörande för leverregenerering laminin utsöndring efter en partiell hepatektomi 27 och krävs för lever stamceller underhåll 28. Vikten av lamininer lever underhåll och förnyelse var grunden för att testa kommersiellt tillgängliga rekombinanta humana lamininer i vårt hepatocyte differentiering systemet.
överlägsen hanpatocyte differentiering uppnåddes på LN-521 och LN-521 / LN-111 substrat jämfört med Matrigel. Härledda HLCs var klart polariserad och organiseras i skålen, och deras cellulära funktion förbättrades signifikant jämfört med deras gelatinösa proteinblandning motsvarigheter. Bakom dessa förbättringar var nedreglering av förorenande colon-, fibroblast- och stamcellsassocierade gener på lamininer, liksom en minskning i celltillväxt och migration associerade genuttryck 10.
Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs här genererar hepatocyt-liknande celler som är närmare sin natur vuxna humana hepatocyter. Processen är reproducerbar, mottaglig för automatisering, och kan vara ett kostnadseffektivt sätt skalas för ansökan. Viktigt har sats till sats variationer har minskat betydligt jämfört med tekniker som använder Matrigel, vilket resulterar i en förbättrad differentiering system för forskare inom detta område. </p>
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes med utmärkelser från Storbritannien regenerativ medicin Platform (MRC MR / L022974 / 1 och MR / K026666 / 1) och ett Kina stipendium.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |