Um protocolo para a determinação da atividade anti-apoptotic relativo de um mAb anti-TNFa usando um mecanismo de neutralização com células WEHI 164 é aqui apresentado. Este protocolo é útil para comparar a força de neutralização das moléculas diferentes com a mesma funcionalidade biológica.
Este protocolo mostra a medição de neutralização atividade apoptotic de TNFa em um modelo de célula de fibroblasto do rato (WEHI 164) usando um mAb anti-TNFa. Além disso, este protocolo pode ser usado para avaliar outras moléculas anti-TNFa, tais como proteínas da fusão. O modelo celular empregado aqui é sensível a apoptose mediada por TNFa quando um fator de estresse adicional é induzido em condições de cultura celular (por exemplo, privação de soro). Esse procedimento exemplifica como executar este ensaio analítico, destacando as principais operações relativas a preparação da amostra, diluição de celular, indução de apoptose e medições espectrofotométricas que são críticas para garantir resultados de sucesso. Este protocolo revela as condições de melhor desempenho relativas à indução de apoptose e eficiente sinal de gravação, levando a valores de baixa incerteza.
Actividade biológica é a medida quantitativa da atividade biológica baseada os atributos de qualidade do produto que estão relacionados com as propriedades biológicas relevantes, Considerando que a quantidade (expressada em massa) é uma medida de físico-química de teor de proteínas. Testes de potência, juntamente com outras metodologias analíticas, são executadas como parte dos estudos de comparabilidade, estabilidade e conformidade do produto. Neste sentido, medições de potência são usadas para demonstrar que lotes do produto conhecer os atributos de qualidade críticos (CQAs) ou critérios de aceitação durante todas as fases dos ensaios clínicos e após aprovação do mercado.
Apoptose morte celular programada, naturalmente ocorrem quando as células estão infectadas com um vírus, ou quando as células estão estressadas por um ambiente fator que compromissos celular viabilidade e função1,2. Entre outros, inibição de apoptose, ou neutralização biológica, é um dos mecanismos terapêuticos principalmente conhecidos de mAbs, particularmente no tratamento de doenças crônicas, tais como desordens inflamatórias imune-mediada. Moléculas de anti-TNFa exercem suas propriedades terapêuticas, bloqueando a interação do fator de necrose tumoral alfa (TNFa) com o p55 e p75 célula superfície receptores3, evitando os caminhos de sinal que finalmente levam a apoptose celular.
TNFa pode produzir inflamação em algumas doenças crônicas4. TNFa spuriously é secretada para o meio extracelular por macrófagos, que são sentinelas do sistema imunitário inato e os principais intervenientes neste tipo de doença5. Como um caminho comum, desregulamentação TNFa é associada com a patogênese destas doenças. Sem controle e sob constante indução e estresse celular, TNFa induz a degeneração do tecido e morte celular, finalmente levando à artrite reumatoide, doença de Crohn e outros perfis patológicos6.
Antagonistas TNF que bloquear a interação entre o TNF e seus receptores foram cada vez mais usadas como uma terapia eficaz para reduzir a sintomatologia e impedem a progressão dessas doenças. Hoje em dia, medicamentos anti-TNFa são amplamente usados para controlar a concentração sistêmica desta citocina, evitando ainda mais a degeneração dos tecidos envolvidos. Nesse sentido, fornecer um bioensaio robusto e reprodutível para descrever a capacidade específica de uma droga para alcançar seu efeito biológico é imperativo.
Neste protocolo, crítica passos-identificado durante o desenvolvimento de um ensaio de neutralização-para a medição do sucesso de potência biológica são destacadas, com uma ênfase particular sobre as habilidades necessárias para executar o método analítico-bio. Este método bio-analítico fornece informações úteis comparabilidade entre diferentes lotes ou anti-TNFa medicamentos quando comparado a uma substância de referência clinicamente testado.
Esta caracterização ajuda a determinar a priori o comportamento biológico de uma molécula em desenvolvimento antes caros e demorados testes clínicos são conduzidos. Também é útil para a liberação de lotes de um produto de droga aprovada. Vale ressaltar que estes ensaios são úteis para determinar se uma molécula possui um efeito biológico adequado sobre seu mecanismo de ação. O método bio-analítico apresentado neste tutorial é criticamente importante para a comparação de moléculas diferente…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de ciência e tecnologia (CONACYT), México conceder PEI CONACYT 2015 220333, sem participação na concepção do estudo.
WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |