Bestemmelse af den Relative potens af en Anti-TNF monoklonale antistof (mAb) af Neutralizing TNF ved hjælp af en In Vitro bioanalytisk metode

Summary

En protokol til bestemmelse af relativ anti-apoptotiske aktiviteten af en anti-TNFα mAb ved hjælp af en neutralisering mekanisme med WEHI 164 celler er præsenteret her. Denne protokol er nyttig til sammenligning neutralisering styrken af forskellige molekyler med den samme biologiske funktioner.

Abstract

Denne protokol viser måling af apoptotiske aktivitet neutralisering af TNFα i en mus fibroblast celle model (WEHI 164) ved hjælp af en anti-TNFα mAb. Denne protokol kan desuden bruges til at evaluere andre anti-TNFα molekyler, såsom fusion proteiner. Den cellulære model ansat her er følsom over for TNFα-medieret apoptose, når en yderligere stressfaktor er induceret i celle kultur betingelser (fx serum afsavn). Denne fremgangsmåde er et eksempel på hvordan man kan udføre denne analytisk assay, fremhæve de centrale operationer vedrørende prøveforberedelse, celle fortynding, apoptose induktion og spektrofotometriske målinger, der er afgørende for at sikre succesfulde resultater. Denne protokol afslører de bedst ydende betingelser med hensyn til apoptose induktion og effektiv signal optagelse, fører til lav usikkerhed værdier.

Introduction

Biologiske potens er den kvantitative mål for biologisk aktivitet baseret på de analyserede produktattributter, der er knyttet til de relevante biologiske egenskaber, mængde (udtrykt i masse) er en fysisk-kemiske foranstaltning af proteinindhold. Potens tests, sammen med andre analytiske metoder, der udføres som en del af produktet conformance, stabilitet og sammenlignelige undersøgelser. I denne forstand bruges potens målinger til at vise at produktet batcher opfylder kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) eller kriterier for accept i alle faser af kliniske forsøg og efter markedet godkendelse.

Apoptose er programmeret celledød, naturligt forekommende når cellerne er smittet med en virus, eller når cellerne er understreget af en miljømæssig faktor at kompromiser cellulære levedygtighed og funktion^1,2. Blandt andre er apoptose hæmning eller biologiske neutralisering, en af de hovedsagelig kendt terapeutisk mekanismer af mAbs, navnlig i behandlingen af kroniske sygdomme, såsom immun-medieret inflammatoriske lidelser. Anti-TNFα molekyler udøve deres terapeutiske egenskaber ved at blokere interaktion af tumor nekrose faktor alfa (TNFα) med p55 og p75 celle overfladen receptorer³, hvilket forhindrer signal veje, der til sidst føre til cellulært apoptose.

TNFα kan producere betændelse i nogle kroniske sygdomme⁴. TNFα udskilles spuriously i det ekstracellulære miljø af makrofager, der er vagter af den medfødte immunsystem og de vigtigste aktører i denne form for sygdom⁵. Som et fælles sti er TNFα deregulering knyttet til patogenesen af disse sygdomme. Uden kontrol og under konstant induktion og cell stress inducerer TNFα celle død og væv degeneration, i sidste ende fører til reumatoid arthritis, Crohns sygdom og andre patologiske profiler⁶.

TNF-antagonister, der blokerer for samspillet mellem TNF og dets receptorer er i stigende grad blevet brugt som en effektiv behandling at reducere symptomatologi og hindre progressionen af disse sygdomme. I dag, er anti-TNFα drug produkter almindeligt brugt til at styre den systemiske koncentration af dette cytokine, dermed forhindre yderligere degeneration af involverede væv. I denne forstand er at give en reproducerbar og robust bioassay for at beskrive et lægemiddel særlige evne til at nå sin biologiske virkning bydende nødvendigt.

I denne protokol, kritiske trin-identificeret under udviklingen af en neutralisering assay-for vellykket måling af biologiske potens er fremhævet, med særlig vægt på de færdigheder, der kræves for at udføre den bio-analysemetode. Denne bio-analytiske metode giver nyttige sammenlignelige oplysninger mellem forskellige partier eller anti-TNFα lægemidler i forhold til en klinisk testet referencestof.

Protocol

1. forberedelse af medier og løsninger forberede næringssubstratet: RPMI-1640 med 10% FBS, pH 7,4. Forbered assay næringssubstratet: RPMI-1640 uden phenol rød, men med 1% FBS, pH 7,4. Forberede celle vaskeopløsning: DPBS Mg – og Ca-gratis løsning med 0,02% EDTA, pH 7,4. Forberede celle detachement løsning: 0,125% trypsin med 1 mM EDTA. Tø 100 mL 0,25% opløsning af trypsin-EDTA og overføre…

Representative Results

Dosis-respons Graf (med kontrol) Figur 1 repræsenterer luminescence svar versus mAb koncentration. Denne sigmoide funktion eksemplificerer caspase 3 og 7 release assay dyrkningsmedium på grund af celle lysering. Celledød forstærkes af serum sult plus TNFα signalering induktion. Derfor, anti-TNFα molekyle (mAb) interagerer med cytokin, hæmmende (af sterisk hindring) sin interaktion med TNF celle receptoren. Dette forårsager celle o…

Discussion

Denne beskrivelse hjælper til at bestemme på forhånd den biologiske opførsel af et molekyle under udvikling før dyre og tidskrævende kliniske forsøg er gennemført. Det er også nyttigt for batch til batch release af en godkendt lægemiddel produkt. Det er værd at nævne, at disse analyser er nyttige til at bestemme hvis et molekyle har en passende biologisk virkning med hensyn til dets virkningsmekanisme. Den bio-analytiske metode præsenteres i denne tutorial er kritisk vigtige til sammenligning af for…

Materials

WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium	ATCC	30-2001	Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red	GIBCO	11835-030	Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red	GIBCO	25200-056	Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium	GIBCO	14190-136	Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein	R&D Systems	210-TA-020	Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG	HyClone	SH3089803	Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	HyClone	SH3007103	Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit	Promega	G8093	Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent	J.T.Baker	8993-01	—
Sample mAb Adalimumab	Probiomed	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab	Abbvie	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software	Molecular Devices	—	SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator	Revco	30482	Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood	The Baker Company	200256	Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2