Bestimmung der relativen Potenz von einer Anti-TNF monoklonaler Antikörper (mAb) durch neutralisieren TNF mit einer In Vitro bioanalytische Methode
Summary
Ein Protokoll für die Bestimmung der relativen Anti-apoptotische Aktivität eine Anti-TNF-MAB WEHI 164 Zellen eine Neutralisation Mechanismus mit wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll eignet sich für die Neutralisation Stärke der verschiedenen Moleküle mit der gleichen biologischen Funktionen zu vergleichen.
Abstract
Dieses Protokoll zeigt die Messung des apoptotischen Aktivität Neutralisierung TNF in einem Fibroblast Zellen Mausmodell (WEHI 164) mit einem Anti-TNF-mAb. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, andere Anti-TNF-Moleküle, wie zum Beispiel Fusionsproteine zu bewerten. Die zelluläre Modell hier beschäftigt ist empfindlich gegen TNF-vermittelten Apoptose, wenn ein zusätzlicher Stressfaktor in Zelle Kulturbedingungen (z. B. Serum Deprivation) induziert wird. Dieses Verfahren ist ein Beispiel für gewusst wie: Ausführen dieser analytische Assay, Hervorhebung der wichtigsten Vorgänge im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung, Zelle Verdünnung Apoptose-Induktion und photometrische Messungen, die entscheidend für die erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten. Dieses Protokoll zeigt die beste Leistung-Bedingungen zur Apoptose-Induktion und effiziente Signal aufzeichnen, was zu niedrigen Unsicherheit Werte.
Introduction
Biologische Potenz ist die quantitative Messung der biologischen Aktivität basierend auf den definierten Produkt-Attribute, die die relevanten biologischen Eigenschaften verknüpft sind, während Menge (in Masse) eine physikalisch-chemische Maßnahme der Proteingehalt ist. Potenz-Tests, zusammen mit anderen analytischen Methoden sind im Rahmen der Produktkonformität, Stabilität und Vergleichbarkeit Studien durchgeführt. In diesem Sinne dienen die Potenz Messungen nachweisen, dass Produktchargen der kritischen Qualitätsattribute (CQAs) oder Akzeptanzkriterien in allen Phasen der klinischen Studien und nach Marktzulassung erfüllen.
Apoptose programmierter Zelltod, natürlich vorkommende, wenn Zellen infiziert sind, mit einem Virus oder wenn die Zellen durch einen ökologischen betonte, dass Kompromisse zellulären Lebensfähigkeit und Funktion1,2Faktor. Unter anderem zählt Apoptose-Hemmung oder biologische Neutralisation, die hauptsächlich bekannten therapeutischen Mechanismen der mAbs, insbesondere bei der Behandlung von chronischen Krankheiten, wie immun-vermittelte entzündliche Erkrankungen. Anti-TNF-Moleküle ausüben ihrer therapeutischen Eigenschaften durch die Blockierung der Interaktion von Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) mit dem p55 und p75 Zelle Oberfläche Rezeptoren3, wodurch Signalwege, die schließlich zur zellulären Apoptose führen.
TNF kann Entzündungen in einigen chronischen Krankheiten4produzieren. TNF wird fälschlicherweise in das extrazelluläre Milieu durch Makrophagen, abgesondert die Wachposten des angeborenen Immunsystems und die Hauptakteure in dieser Art von Krankheit5sind. Als ein gemeinsamer Weg ist TNF Deregulierung der Pathogenese dieser Erkrankungen zugeordnet. Ohne Kontrolle und unter ständiger Induktion und Zelle Stress induziert TNF Tod und Gewebe Zelldegeneration, letztlich zu rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn und andere pathologische Profile6.
TNF-Antagonisten, die das Zusammenspiel von TNF und seine Rezeptoren blockieren kamen verstärkt zum Einsatz als eine wirksame Therapie zur Verringerung der Symptomatik und behindern das Fortschreiten dieser Erkrankungen. Heutzutage sind Anti-TNF-Arzneimitteln verbreitet, die systemische Konzentration dieses Zytokin damit Verhinderung weiterer Degeneration der betroffenen Gewebe zu kontrollieren. In diesem Sinne ist es unerlässlich, bietet eine reproduzierbare und robuste Bioassay um zu beschreiben, die spezifische Fähigkeit eines Arzneimittels, seine biologische Wirkung zu erzielen.
In diesem Protokoll, kritischen Schritte bei der Entwicklung eines Neutralisation Assays identifiziert-für die erfolgreiche Messung der biologischen Potenz markiert sind, mit besonderem Schwerpunkt auf die Fähigkeiten, um die Bio-analytische Methode ausgeführt werden. Diese Bio-analytische Methode informiert nützliche Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Chargen oder Anti-TNF Arzneimittel im Vergleich zu einem klinisch getesteten Referenzstoff.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Charakterisierung hilft apriorische das biologische Verhalten eines Moleküls in der Entwicklung um zu bestimmen, bevor teure und zeitaufwendige klinische Studien durchgeführt werden. Es ist auch nützlich für die Freilassung von Charge zu Charge eines Produkts zugelassenes Medikament. Es ist erwähnenswert, dass diese Tests eignen sich zum bestimmen, ob ein Molekül eine ausreichende biologische Wirkung bezüglich sein Wirkungsmechanismus hat. Die Bio-analytische Methode präsentiert in diesem Tutorial …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Council of Science und Technology (CONACYT), Mexiko gewähren PEI CONACYT 2015 220333, ohne Teilnahme an das Design der Studie.
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
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