여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
빛 현미경 수준에서 모든 기술의 진보에도 불구하고, 전자 현미경은 시냅스 연락처 등의 신경 세포의 미세 구조 및 형태 학적 세부 사항을 검토하고 특성화 신경 과학에서 유일한 도구 남아있다. 전자 현미경에 대한 뇌 조직의 잘 보존 엄격한 극저온 고정 방법에 의해 얻을 수 있지만, 이러한 기술은 오히려 비용이 많이 드는 및 확인 된 신경 시스템의 연결을 이해하는 것이 중요하다 immunolabeling의 사용을 제한 할 수 있습니다. 동결 교체 방법 immunolabeling 함께 극저온 고정 조합을 허용하도록 개발되었다. 그러나 이러한 방법 론적 접근 방법의 재현성은 일반적으로 비용이 많이 드는 냉동 장치에 의존합니다. 또한,이 기술로 신뢰할 수있는 결과를 달성하는 것은 매우 시간이 많이 걸리는과 기술 - 도전이다. 따라서, 특히 아크롤레인과 정착액 전통적인 화학적 고정 뇌, 전자를 결합하는 동시에 효율적인 저비용 방법 유지면역 조직 화학 염색과 현미경. 여기서는 영장류 뇌 조직의 보존을 초래하고 면역 및 투과 전자 현미경 검사를 미리 매립 호환 화학 아크롤레인을 고정하여 안정적인 실험 프로토콜을 제공한다.
서론
공 초점 및 두 광자 현미경을 포함한 광학 현미경은, 2, 다른 것들 한 가운데, 생체 신경 과정에서 공부를위한 효율적인 도구가 될 입증되었습니다. 빛 현미경 (LM) 레벨의 전형적인 공간 분해능은 극 자외선과 연 X 선 현미경 등의 다른 광원을 사용하여 약 200 nm의 최근의 기술적 진보하지만, 특히 거의 10 nm의 공간 해상도 (3)이 해상도를 증가 4, 5. 화상의 다른 기술적 진보는 조직 학적으로 자기 공명 영상을 조합하여 생체 내에서 수초 만 전자 현미경 (EM) 레벨 6, 7에서 전통적으로 측정 하였다 파라미터의 두께를 측정하는 신규 방법을 제공하는 것을 포함한다. AlthouGH LM 수준에서 이러한 진보는 시냅스 접촉 생계 프로세스, 구조 상세도 및 특성을 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하며, 0.5 nm의 도달 할 수있는 해상도를 제공 EM으로 달성 ....
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프로토콜
윤리 문 : 동물과 관련된 모든 프로토콜은 Comité 드 보호 데스 Animaux 드 난 대학 라발에 의해 승인되었고, 실험 동물의 관리 및 사용 (에드 2.)에 동물 관리 안내서에 캐나다 의회에 따라 만들어졌다. 여기에 설명 된 프로토콜은 약 800g의 성인 동물에 최적화되었다. 고정액의 볼륨은 동물의 크기에 따라 조정되어야한다.
Transcardiac 관류를위한 솔루션 1. 준비
- 다음 단계에있어서, 50 mM의 나트륨, 인산 완충 용액 (PBS) 용액 1 L를 준비한다. 관류 전에 대부분 24 시간에서 솔루션을 준비하고 사용할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.
- 1 L의 비커에, 증류수 800 mL로 측정한다. 무수 이염 기성 인산 나트륨 5.87 g을 추가 (NA 2 HPO 4) 수화물 염기성 인산 나트륨 1.20 g (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O), 9 g염화나트륨 (NaCl을). 용해 저어.
- 서서히 5 N NaOH를 첨가하여 7.4로 pH를 조정한다. 1 L.의 총 부피에 도달하기 위해 증류수를 추가
주의 : NaOH를가 부식성 화합물이다. 적절한 개인 보호....
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결과
이 섹션에서는 화학적으로 3 %의 아크롤레인의 혼합물을 4 % PFA로 고정 면역 염색 영장류 뇌 조직, 송신 EM 수준에서 관찰 다음 얻어진 대표적인 결과를 제시한다. 비교적 그대로 수초 이중 막 (도 2A)의 깔끔한 시각화로 나타낸 바와 같이 우리는 미세 구조의 양호한 보존을 달성했다. 미세 환경에서의 연결 요소와 더불어 시냅스 접촉이 용이하게 (도 2b)에 의해 식별 될 수있다. 디아 미노 벤지딘 (DAB)로 표지 면역 침전의 연결 요소들은 채워진 세포질 또는 axoplasm하여 EM 레벨로 인식된다. 세포막 및 세포 소기관의 외부 표면은 일반적으로 전자 밀도 침전물 (도 3)가 줄 지어있다.
이 특정 실험에서, 우리는 항체의 AGA를 사용외부 (Play 에디션) .......
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토론
본 문서에서는, 비 - 인간 영장류 및 EM 샘플 시험에 적합한 사전 매립의 면역 조직 화학 (rongeur)로하는 신뢰성 프로토콜을 제시한다. 같은 CEMOVIS 전형적인 냉동-EM은, 뇌의 미세 구조의 좋은 보존을 제공하지만, 그것은 또한 면역 조직 화학 (12)의 사용을 제한합니다. 극저온 대체 및 Tokuyaso 기술을 포함한 다른 기술, 면역 조직 화학을 매립 후 허용하지만, 이러한 기술로 인해 과정에서 필요한 추가 장치 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 12, 14, 15 스킬에 도전 할 수있다. 또한, 효율적 크라이 정 방법을 사용하기 위해, 시료 (29 기압에서 28 ~ 10㎛ 냉동 고압을 사용하는 경우, 두께 2.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
본 연구는 자연 과학 및 (MP에 NSERC, 401848-2011) 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원되었다. MP는 퐁 드 공들인 퀘벡 - 상테 (FRQ-S)에서 경력 상을 받았다. LE는 FRQ-S (FRQ-S 29,441 14D) 박사로부터 수신자의 교제이었다. 우리는 기술 지원을 마리 Josée Wallman 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이염 기성 무수 인산 나트륨 (Na2< / sub>HPO4< / sub>) | Fisher scientific | S374-500 | |
| 일 염기성 일 수화물 인산 나트륨 (NaH2< / sub>PO4&# 183; H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| 하이드록시메틸 아미노메탄 (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1 N 희석. 제품이 부식성이 있습니다. 적절한 보호 장치와 함께 사용하십시오. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5 N 희석. 제품이 부식성이 있습니다. 적절한 보호 장치와 함께 사용하십시오. |
| 파라포름알데히드(PFA) | 시그마 | P6148 | 4% 희석. 제품은 분말 형태로 휘발성이 높고 독성이 강합니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서 주의해서 사용하십시오. |
| 아크롤레인(90%) | 시그마 | 110221 | 3% 희석. 제품은 독성이 강합니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서 사용하십시오. |
| 부검 환기 테이블 | Mopec | CE400 | |
| 전자 관류 펌프 | 콜 파머 | masterflex L/S 7523-90 | |
| 바늘 (관류) | 테루모 | NN-1838R | 18 G 11/2 |
| 바늘 | 테루모 | NN-2713R | 21 G 1/2 |
| 케타민 | 20 mg/kg | ||
| 자일라진 | 4 mg/kg | ||
| 아세프로마진 | 0.5 mg/kg | ||
| 메스 | |||
| 칼 | 깃털 랜스 | 201011 J9913 | No.22 수술 및 No. 11 EM |
| 외과 가위 | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | 장치가 허용하는 경우 매번 사용하기 전에 블레이드를 보정 |
| Vibratome 면도날 | 질레트 | GIN 642107 | |
| 글리세롤 | 피셔 사이언티픽 | G33-4 | 30 % 희석 |
| 에틸렌 글리콜 | Fisher scientific | E178-4 | 30% 희석 |
| 수소화붕소나트륨(NaBH4) | Sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum (NHS) | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% 희석 |
| 냉어류 젤라틴 | Aurion | 900.033 | 0.5% 희석. 원제품은 1차 항체 40%, |
| SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 희석 |
| 1차 항체, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 희석 |
| 1차 항체, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1,000 희석 |
| Biotinylated 2차 항체, 염소 | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1,000에 집중되어 있습니다. 희석 |
| Biotinylated 2 차 항체, 마우스 | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1,000 희석 |
| Vectastain 엘리트 ABC 키트 | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µ L/mL A 및 B 각 |
| 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) | Sigma | D5637 | 0.05% 희석. 제품은 분말 형태로 휘발성이 높고 독성이 있습니다. 싱크대에 쓰레기를 버리지 마세요. |
| 과산화물 (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0.005% 희석 |
| 사산화오스뮴(OsO4) | 전자 현미경 과학 | 2% 19152 4% 19150 | 원래 용액은 2 또는 4%일 수 있습니다. 최종 1% 희석을 계산하는 데 어떤 것이 사용되는지 주의하십시오. 제품은 빛에 매우 민감합니다. 오스뮴은 독성이 매우 높습니다. 적절한 보호 장치가 있는 환기 후드 아래에서만 사용하십시오. |
| Durcupan 발수 에폭시 수지 | Sigma | A: M 에폭시 수지 (44611) B: 경화제 964 (44612) C: 가속기 960 (DY 060) (44613) D: 가소제 (44614) | 58 °에 48 h를 중합하십시오; C 쓰레기를 버리기 전에. |
| Alumium 컵 | 전자 현미경 과학 | 70048-01 | |
| 에탄올 | 상업용 알코올 | 1019C | 적절한 농도의 증류수에 희석 |
| 프로필렌 산화물 | 전자 현미경 과학 | 20401 | 유기 용매. 휘발성이 높고 독성이 있습니다. 환기 후드 아래에서 사용하십시오. |
| 비코팅된 중간 유리 슬라이드 | 뇌 연구소 | 3875-FR | 그리스 표면에는 미네랄 오일이 있습니다. |
| 플라스틱 필름 (Aclar 임베딩 필름) | 전자 현미경 과학 | 50425-25 | 그리스 표면에는 미네랄 오일이 있습니다 |
| 초소형 | Leica UC7 | EM UC7 | |
| 다이아몬드 트리밍 도구 (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | 유리 칼을 선택적으로 사용할 수 있습니다 |
| . 울트라 45도; Diatome 다이아몬드 나이프 | Diatome | MC13437 보트가 장착되어 | |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150메시 구리 그리드 전자 | 현미경 과학 | G150-cu | |
| 그리드 박스 | 전자 현미경 과학 | 71138 | 최대 100개의 그리드를 저장할 수 있습니다 |
| 구연산나트륨 | Anachemia | 81983 | |
| 질산납 | Sigma | L-6258 | 1.33 질산납 g 및 1.76 42 에 희석된 구연산나트륨 g; 미리 끓이고 냉각된 증류수 mL 8 1 mL N NaOH는 질산납에서 시트르산납으로의 전환이 완료된 후에 추가됩니다. pH는 약 12여야 합니다. 용액을 밀폐 플라스틱 병에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. |
| 주사기 | terumo | SS-05L | 5 mL |
| 주사기 필터 | Corning | 431222 | 0.2 µ m |
| 흡수지 (bibulous paper) | 전자 현미경 과학 | 70086-1 | |
| 파라 필름 | 실험실 필름 | PM-999 | |
| 미네랄 오일 | 시그마 | M5904 |
참고문헌
- Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
- Zhou, Y., et al.
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재인쇄 및 허가
