إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Summary

هنا، ونحن نقدم ل، منخفضة التكلفة سهلة، والوقت كفاءة بروتوكول لإصلاح أنسجة المخ كيميائيا الرئيسيات مع تثبيتي الأكرولين، مما يسمح للحفاظ على المدى الطويل والتي تتوافق مع ما قبل التضمين المناعية للانتقال المجهر الإلكتروني.

Abstract

على الرغم من كل التقدم التكنولوجي على مستوى المجهر الضوئي، لا يزال المجهر الإلكتروني الأداة الوحيدة في علم الأعصاب لدراسة وتوصيف تفاصيل التركيبية والشكلية من الخلايا العصبية، مثل الاتصالات متشابك. حفظ جيد للأنسجة المخ لالمجهر الإلكتروني يمكن الحصول عليها عن طريق أساليب البرد تثبيت صارمة، ولكن هذه التقنيات مكلفة نوعا ما، والحد من استخدام immunolabeling، وهو أمر حاسم لفهم التواصل بين الأنظمة العصبية التي تم تحديدها. وقد تم تطوير طرق تجميد استبدال السماح للمزيج من البرد التثبيت مع immunolabeling. ومع ذلك، فإن استنساخ هذه المقاربات المنهجية عادة ما تعتمد على الأجهزة تجميد مكلفة. وعلاوة على ذلك، وتحقيق نتائج موثوقة مع هذه التقنية هو جدا تستغرق وقتا طويلا وتحدي المهارات. وبالتالي، فإن الدماغ ثابتة كيميائيا التقليدية، لا سيما مع تثبيتي الأكرولين، يبقى طريقة فعالة وقت ومنخفضة التكلفة للجمع بين الإلكترونالمجهر مع المناعية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول تجريبي موثوق باستخدام تثبيت الأكرولين الكيميائي الذي يؤدي إلى الحفاظ على أنسجة المخ الرئيسيات ومتوافق مع ما قبل التضمين المناعية ونقل الإلكترون الفحص المجهري.

Introduction

المجهر الضوئي، بما في ذلك متحد البؤر واثنين من الفوتون المجهري، وقد ثبت أن تكون أداة فعالة للدراسة في العمليات العصبية الجسم الحي، من بين أمور أخرى ^{1 و 2.} على الرغم من أن القرار المكانية نموذجي على مستوى الضوء مجهرية (LM) ما يقرب من 200 نانومتر، والتقدم التكنولوجي الأخيرة باستخدام مصادر الضوء المختلفة، مثل الأشعة فوق البنفسجية المدقع وناعمة المجهر أشعة X، وأبرزها زيادة هذا القرار إلى ما يقرب من 10 القرار المكانية نانومتر ^{3 و 4 و 5.} وتشمل التطورات التكنولوجية الأخرى في مجال التصوير الجمع بين التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة وتوفر طريقة جديدة لقياس سمك غمد المايلين في الجسم الحي، والمعلمة التي كانت قابلة للقياس تقليديا فقط على مستوى الكترون مجهرية (EM) ^{6 و 7.} Althouغ هذه التطورات على مستوى LM توفر أداة ممتازة لدراسة العمليات الحية، على عرض تفصيلي وتوصيف البنى، مثل الاتصالات متشابك، لا يمكن أن يتحقق إلا مع EM، الذي يقدم قرار يمكن أن تصل إلى 0.5 نانومتر. ومع ذلك، والمراقبة على مستوى EM تتطلب العينات أن القتلى وتغيير في بعض النواحي، مع المثبتات الكيميائية والعمليات الجفاف، من أجل الحفاظ على التهندس الخلوي. وهكذا، ودراسة العينات البيولوجية بدقة عالية يمكن أن يكون تحديا بسبب الأضرار الناجمة عن الإشعاع من شعاع الالكترون، وعلى النقيض منخفضة، والانحرافات الهيكلية من الأغشية، أو حتى وجود القطع الأثرية التي يمكن أن تحدث بعد الجفاف والايبوكسي تضمين ^{8 و 9 و 10.}

الحفاظ على العينات في شكل الأصلي من أجل التحليل البنيوي لا يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام "كرو EM الأقسام المزججة" أو CEMOVIS، نهج باجتزاء أنيشمل تجميد بسرعة وتضمينها العينة في الجليد الزجاجي، والنظر في أقسام تحت EM عند درجة حرارة المبردة ^{11 و 12.} يسمح هذا الإجراء لفحص عينات حين أنها لا تزال صلبة والمائية بشكل كامل، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية التي يسببها الجفاف العمليات ^13. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي إضافية أجهزة لالبرد ultramicrotomy، وكذلك أجهزة إضافية على EM القياسية، وذلك للسماح هذه الملاحظة في درجات حرارة منخفضة جدا، والتي تولد تكاليف إضافية كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج CEMOVIS يحول دون استخدام تقنيات immunolabeling، منذ الأجسام المضادة وعادة ما يكون لتكون المحتضنة في RT. بدلا من ذلك، فمن الممكن الجمع بين تحليل التركيبية للإجراءات المناعى باستخدام نهج تجميد الاستبدال، يتم خلالها إذابة العينات الثابتة البرد ببطء بينما غمر في المواد الكيميائية البرد واقية وهي عشرأون جزءا لا يتجزأ من راتنجات المتخصصة، مثل Lowicryls. بعد تضمين immunolabeling يمكن بعد ذلك أجريت على هذه المواد ^(12). ومع ذلك، وتقنيات تجميد الإحلال والبرد تثبيت هي مضيعة للوقت. فهي تتطلب تركيب معدات إضافية ولا تزال تتطلب عينات أن تتعرض لالمذيبات العضوية وتثبيتي الكيميائية التي يمكن أن تغير التهندس الخلوي، على الرغم من استخدام درجة حرارة منخفضة ^{14 و 15.} وبالتالي، على الرغم من كل التقدم التكنولوجي سواء على مستوى LM وEM، تثبيت الكيميائي للأنسجة المخ، وخاصة مع الأكرولين، لا تزال منخفضة التكلفة وفعالة وقت طريقة للجمع بين المناعية مع EM ^16.

في العقود الماضية، كانت هناك العديد من المحاولات لإيجاد مزيج من الألدهيدات التي توفر أفضل الحفاظ على الأنسجة. قبل 1960s، وكان مثبت الكيميائية الوحيدة التي أعطت نتائج مقبولة للEM رباعي أكسيد الأوزميوم. ومع ذلك، رباعي أكسيد الأوزميوم عالية السمية ومكلفة، مما يحول دون استخدامه من خلال نظام الأوعية الدموية لإصلاح أجهزة مثل الدماغ. وقدم الأكرولين في أواخر 1950s باعتبارها وسيلة يمكن الاعتماد عليها للحيوان الحفاظ على النسيج مناسبة للمراقبة EM الهياكل الخلوية ^(17). انها تخترق الأنسجة أكثر عمقا ويتفاعل بسرعة أكثر من الألدهيدات أخرى عندما تستخدم لتثبيت عن طريق الغمر ويسمح الحفاظ جيد للمكونات حشوية، مع انكماش الحد الأدنى من الأنسجة ^(17). مثل هذه الميزة تعطي الأكرولين تثبيت ميزة واضحة على الألدهيدات أخرى عند استخدامها في أنسجة جديدة، من خلال السماح لتوطين أكثر دقة من الذين يعيشون مركبات جزيئية، مثل الإنزيمات والبروتينات الأخرى ^18. في الواقع، تم التحقق من صحة ذلك من خلال سنوات وسيلة سهلة وفعالة ومنخفضة التكلفة لتثبيت التصور على مستوى EM في كثير من الأنواع، بما في ذلك البرمائيات والقوارض، كما stabili بكفاءةZES الببتيدات والبروتينات، تحتفظ استضداد ويوفر التركيب الدقيق سليمة نسبيا عندما تستخدم بالاقتران مع ألدهيد آخر تثبيتي ^{16 و 18 و 19 و 20 و 21.} بروتوكولات لتثبيت الأكرولين في القوارض ومنذ ذلك الحين تم توحيدها واستخدامها على نطاق واسع، لا سيما من قبل مجموعة بيكيل، لتنفيذ immunolabeling المزدوج لEM ^{16، 22.} وقد استخدمت مجموعات قليلة الأكرولين التثبيت في الأنسجة غير البشرية الرئيسيات الدماغ ^23. ومع ذلك، على حد علمنا، هناك واحد فقط بروتوكول المنشورة التي تصف كفاءة التثبيت الكيميائية مع الأكرولين في الرئيسيات غير البشرية التي تتوافق مع EM immunolabeling ^24.

في هذه المقالة، ونحن نقدم وسيلة سهلة وموثوق بها لإصلاح بكفاءة كيميائيا غير همهمة،على العقول الرئيسيات مع الأكرولين، والسماح لحفظ يحتمل أن تكون طويلة الأجل جنبا إلى جنب مع ما قبل التضمين immunolabeling وEM نقل الفحص.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات من قبل COMITE دي حماية قصر Animaux DE L'جامعة لافال وقدمت وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان دليل لرعاية واستخدام حيوانات التجارب (إد 2). تم تحسين بروتوكول صفها هنا للحيوانات البالغة حوالي 800 غرا?…

Representative Results

في هذا القسم، نقدم نتائج ممثل التي تم الحصول عليها بعد الملاحظة، وعلى مستوى EM الإرسال، من immunostained أنسجة المخ الرئيسيات ثابتة كيميائيا مع خليط من 3٪ و 4٪ الأكرولين PFA. حققنا الحفاظ جيدا على التركيب الدقيق، كما يتضح من غمد المايلين سليمة نسبيا والتصور أ…

Discussion

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول موثوق بها لنضح transcardiac من الرئيسيات غير البشرية والمناعية قبل التضمين مناسبة لEM فحص العينة. وعلى الرغم من نموذجي البرد EM، مثل CEMOVIS، يوفر المحافظة لا بأس به من التركيب الدقيق الدماغ، كما أنه يحد من استخدام المناعية ^12. تقنيات أ?…

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Feather           lance	201011           J9913	No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% dilution
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4)	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Cold-fish gelatin	Aurion	900.033	0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron microscopic science	2% 19152           4% 19150	Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin	sigma	A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)	Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups	Electron microscopic science	70048-01
Ethanol	commercial alcohols	1019C	Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide	Electron microscopic science	20401	Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides	brain research laboratories	3875-FR	Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film)	Electron microscopic science	50425-25	Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome	Leica UC7	EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim)	Diatome	UT 1081	Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife	Diatome	MC13437	equipped with a boat
Xylenes	Fisher scientific	X5SK-4
150-mesh copper grids	Electron microscopic science	G150-cu
grid-box	Electron microscopic science	71138	Can store up to 100 grids
Sodium citrate	Anachemia	81983
Lead nitrate	sigma	L-6258	Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe	terumo	SS-05L	5 mL
Syringe filter	corning	431222	0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper)	Electron microscopic science	70086-1
Parafilm	Laboratory film	PM-999
Mineral oil	Sigma	M5904