Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Summary

Aqui, nós fornecemos um, de baixo custo fácil, e protocolo de tempo-eficiente para corrigir quimicamente o tecido cerebral dos primatas com fixador acroleína, permitindo a preservação a longo prazo que seja compatível com imunohistoquímica pré-incorporação para microscopia eletrônica de transmissão.

Abstract

Apesar de todos os avanços tecnológicos ao nível da microscopia de luz, microscopia eletrônica continua a ser a única ferramenta em neurociência para analisar e caracterizar detalhes ultra-estruturais e morfológicas de neurônios, como contatos sinápticos. Boa preservação do tecido cerebral para microscopia eletrônica pode ser obtida por métodos de crio-fixação rigorosos, mas essas técnicas são bastante caro e limitar o uso de imunomarcação, que é crucial para entender a conectividade dos sistemas neuronais identificados. métodos de congelação-substituição têm sido desenvolvidos para permitir que a combinação de crio-fixação com imunomarcação. No entanto, a reprodutibilidade dessas abordagens metodológicas geralmente se baseia em dispositivos de congelamento caros. Além disso, a obtenção de resultados confiáveis ​​com esta técnica é muito demorado e desafiador habilidade. Assim, o cérebro quimicamente fixo tradicional, especialmente com fixador acroleína, continua a ser um método tempo-eficiente e de baixo custo para combinar electrõesmicroscopia com imuno-histoquímica. Aqui, nós fornecemos um protocolo experimental de confiança utilizando a fixação de acroleína química que conduz para a preservação do tecido do cérebro primata e é compatível com o pré-incorporação exame microscópico imuno-histoquímica e de transmissão de electrões.

Introduction

Microscopia de luz, incluindo confocal e microscopia de dois fótons, provou ser uma ferramenta eficiente para estudar em processos neuronais in vivo, entre outras coisas ^{1, 2.} Embora a resolução espacial típico no nível de luz microscópica (LM) é aproximadamente de 200 nm, os recentes avanços tecnológicos usando diferentes fontes de luz, tais como a extrema ultravioleta e microscopia de raios-X suave, de forma notável aumento esta resolução para uma nm resolução quase 10 espacial ^{3 , 4, 5.} Outros avanços tecnológicos na imagiologia incluem combinado ressonância magnética com a histologia e proporcionar um novo método para medir a espessura da bainha de mielina, in vivo, um parâmetro que foi tradicionalmente mensurável apenas no nível de microscopia electrónica (ME) ^{6, 7.} although estes avanços no nível LM proporcionar uma excelente ferramenta para o estudo de processos de vida, uma vista de pormenor e caracterização de estruturas, tais como contactos sinápticos, só pode ser conseguido com EM, que oferece uma resolução que podem chegar a 0,5 nm. No entanto, a observação no nível EM requer que os espécimes estar morto e alterado em alguns aspectos, com fixadores químicos e processos de desidratação, a fim de preservar a citoarquitetura. Deste modo, examinando as amostras biológicas com elevada resolução pode ser difícil devido aos danos da radiação do feixe de electrões, de baixo contraste, os desvios estruturais de membranas, ou mesmo a presença de artefactos que podem ocorrer após a desidratação e epoxi incorporação ^{8, 9, 10.}

Preservar os exemplares na sua forma nativa para análise estrutural pode ser conseguido através de "Cryo EM de secções vitrificados" ou CEMOVIS, uma abordagem que seccionamentoenvolve a congelação rápida e a incorporação da amostra em gelo vítreo e examinando as secções sob a EM, a uma temperatura criogénica ^{11, 12.} Este procedimento permite a análise de amostras enquanto ainda estão sólida e completamente hidratado, eliminar artefactos causados por desidratação assim processa ^13. No entanto, este método envolve a dispositivos adicionais para a crio-ultramicrotomia, bem como dispositivos adicionais na EM padrão, a fim de permitir que esta observação a temperaturas muito baixas, que geram custos adicionais significativos. Além disso, a abordagem CEMOVIS opõe-se à utilização de técnicas de imunomarcação, uma vez que os anticorpos normalmente têm de ser incubadas a temperatura ambiente. Em alternativa, é possível combinar a análise ultra-estrutural com os procedimentos de imuno-histoquímica utilizando uma abordagem de congelação-substituição, durante a qual as amostras fixadas com crio são lentamente descongeladas enquanto imersa em produtos químicos crio-protectora e são then incorporados em resinas especializadas, tais como Lowicryls. Pós-incorporação de imunomarcação pode então ser realizada em tal material ^12. No entanto, as técnicas de substituição de congelamento e crio-fixação são demorados. Eles exigem a instalação de equipamento adicional e ainda necessitam de amostras para ser exposta ao solvente orgânico e fixador químico que pode alterar a citoarquitetura, apesar da utilização de uma baixa temperatura de ^{14, 15.} Assim, apesar de todos os avanços tecnológicos, tanto a nível LM e EM, a fixação química do tecido do cérebro, particularmente com acroleína, continua a ser um método de baixo custo e eficiente tempo para combinar imuno-histoquímica com EM ^16.

Nas últimas décadas, foram feitas muitas tentativas para encontrar uma mistura de aldeídos que fornecem a melhor preservação do tecido. Antes de 1960, o único fixador químico que deram origem a resultados aceitáveis ​​para o EM era tetróxido de ósmio. No entanto, o tetróxido de ósmio é altamente tóxico e dispendioso, o que impede o seu uso através do sistema vascular para fixar os órgãos tais como o cérebro. Acroleína foi introduzida no final da década de 1950, como um método de confiança para a preservação do tecido animal adequado para observação EM de estruturas celulares ^17. Ele penetra o tecido mais profundamente e reage mais rapidamente do que outros aldeídos quando utilizados para a fixação por imersão e permite uma boa conservação dos componentes citoplasmáticos, com encolhimento mínimo do tecido ^17. Tal característica dá acroleína fixação uma clara vantagem sobre outros aldeídos quando utilizado em tecido fresco, por permitir uma localização mais exacta de vida compostos moleculares, tais como as enzimas e outras proteínas ^18. Na verdade, foi validado através dos anos como um método fácil, eficiente e de baixo custo de fixação para visualização no nível de EM em muitas espécies, incluindo os anfíbios e roedores, como forma eficiente estabilizazes péptidos e proteínas, mantém a antigenicidade e fornece ultraestrutura relativamente intacto quando usado em combinação com um outro aldeído fixador ^{16, 18, 19, 20, 21.} Os protocolos para a fixação de acroleína em roedores têm desde então sido normalizado e amplamente utilizado, particularmente pelo grupo Pickel, para implementar dupla imunomarcação para o EM ^{16, 22.} Alguns grupos foram utilizados fixação acroleína em tecido do cérebro primata não-humano ^23. No entanto, tanto quanto sabemos, só há um protocolo publicado eficientemente descrevendo fixação química com acroleína em primatas não-humanos, que é compatível com o EM imunomarcação ^24.

Neste artigo, nós fornecemos um método fácil e confiável para corrigir eficientemente quimicamente não-humum cérebros de primatas com a acroleína, permitindo uma conservação potencialmente a longo prazo juntamente com pré-incorporação de imunomarcação e EM transmissão exame.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os protocolos envolvendo animais foram aprovados pelo Comité de Protecção dos Animais de l'Université Laval e foram feitas de acordo com a Canadian Council on Guia do Animal Care para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais (Ed. 2). O protocolo aqui descrito foi optimizado para animais adultos de aproximadamente 800 g. Os volumes de fixador deve ser ajustada de acordo com o tamanho do animal. 1. Preparação de soluções para perfusão transcardíaca </p…

Representative Results

Nesta secção, são apresentados resultados representativos, que foram obtidos após a observação, a nível ME de transmissão, de tecido do cérebro primata imunocoradas quimicamente fixadas com uma mistura de 3% de acroleína e PFA a 4%. Conseguimos uma boa preservação da ultra-estrutura, como indicado pela bainha de mielina relativamente intacto e a visualização puro de membranas duplos (Figura 2A). Contactos sinápticos, juntamente com os elementos neuronais d…

Discussion

Neste artigo, é apresentado um protocolo fiável para perfusão transcardíaca de primatas não-humanos e imuno-histoquímica de pré-embebimento adequado para exame da amostra EM. Embora típico crio-EM, tais como CEMOVIS, fornece uma boa preservação da ultra-estrutura do cérebro, mas também limita a utilização de imuno-histoquímica ^12. Outras técnicas, incluindo a crio-substituição e técnica Tokuyaso, permitem a incorporação de pós-imuno-histoquímica, mas estas técnicas são di…

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Feather           lance	201011           J9913	No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% dilution
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4)	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Cold-fish gelatin	Aurion	900.033	0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron microscopic science	2% 19152           4% 19150	Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin	sigma	A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)	Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups	Electron microscopic science	70048-01
Ethanol	commercial alcohols	1019C	Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide	Electron microscopic science	20401	Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides	brain research laboratories	3875-FR	Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film)	Electron microscopic science	50425-25	Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome	Leica UC7	EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim)	Diatome	UT 1081	Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife	Diatome	MC13437	equipped with a boat
Xylenes	Fisher scientific	X5SK-4
150-mesh copper grids	Electron microscopic science	G150-cu
grid-box	Electron microscopic science	71138	Can store up to 100 grids
Sodium citrate	Anachemia	81983
Lead nitrate	sigma	L-6258	Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe	terumo	SS-05L	5 mL
Syringe filter	corning	431222	0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper)	Electron microscopic science	70086-1
Parafilm	Laboratory film	PM-999
Mineral oil	Sigma	M5904