El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares
Summary
En este trabajo se presenta un nuevo método para estudiar las interacciones de la proteína-proteína usando un biosensores conductimétricos basados en la tecnología híbrida de β-lactamasa. Este método se basa en la liberación de protones al producirse la hidrólisis de β-lactámicos.
Abstract
Biosensores son cada vez más importante y puesto en ejecución en varios campos tales como la detección de patógenos, diagnóstico molecular, monitoreo ambiental y control de la seguridad alimentaria. En este contexto, usamos β-lactamasas como enzimas reportero eficaz en varios estudios de interacción de proteínas. Además, su capacidad para aceptar las inserciones de péptidos o dominios de proteínas estructurados fuertemente alienta el uso de estas enzimas para generar proteínas quiméricas. En un estudio reciente, inserta un fragmento de anticuerpo único dominio en el Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Estos dominios pequeños, también llamados nanobodies, se definen como los dominios de unión a antígeno de anticuerpos de cadena única de camélidos. Como el común de los anticuerpos de doble cadena, presentan alta afinidad y especificidad para sus blancos. La proteína quimérica resultante exhibió una alta afinidad contra su destino conservando la actividad de β-lactamasa. Esto sugiere que las moléculas nanobody y β-lactamasa siguen siendo funcionales. En el presente trabajo, se presenta un protocolo detallado que combina nuestro sistema híbrido de β-lactamasa a la tecnología de biosensores. La unión específica de la nanobody a su objetivo puede ser detectada gracias a una medición conductimétricos de los protones liberados por la actividad catalítica de la enzima.
Introduction
Biosensores son dispositivos analíticos que combinan una interacción bio-molecular con dispositivos de señalización físicos o químicos denominados transductores1. Las señales registradas se pueden interpretar y convertidas para monitorear las interacciones entre las partes inmovilizadas y libres. La mayoría de los biosensores incluyen el uso de un anticuerpo para detectar analitos tales como hormonas o patógeno diferentes marcadores2. Formatos de sensor diferente pueden utilizarse e incluyen biosensores basados en la masa, magnéticos, ópticos o electroquímicos. Estos últimos están entre los más comúnmente usados sensores y funcionan mediante la conversión de un evento de enlace en una señal eléctrica. Las actuaciones y sensibilidades de todos los biosensores basados en anticuerpos son fuertemente dependientes en básicamente dos parámetros: i) la calidad de los anticuerpos y ii) las características del sistema utilizado para generar la señal2.
Los anticuerpos son proteínas dimérica masa molecular alta (150-160 kDa) que se componen de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La interacción entre las cadenas pesadas y ligeras sobre todo se estabiliza por interacciones hidrofóbicas, así como un enlace de disulfuro conservado. Cada cadena incluye un dominio variable que interactúa con el antígeno esencialmente a través de tres regiones hipervariables denominado regiones determinación complementarias (CDR1-2-3). A pesar de numerosos avances en el campo, la expresión a gran escala de anticuerpos completos con sistemas de expresión de bajo costo (por ejemplo, e. coli) a menudo conduce a la producción de proteínas inestables y agregadas. Por esta razón varios fragmentos de anticuerpos han sido diseñados como fragmentos de cadena simple variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Consisten en los dominios variables de respectivamente una pesada y una cadenas ligeras que son covalente por una secuencia de aminoácido sintético. Sin embargo, estos fragmentos a menudo mostrar una estabilidad pobre y tienen la tendencia a agregado, dado que expone gran parte de sus regiones hidrofóbicas al solvente4. En este contexto, fragmentos de anticuerpos de camélidos de cadena única, denominadas nanobodies o VHHs, parecen ser excelentes alternativas de ScFvs. Estos dominios corresponden a los dominios variables de anticuerpos de cadena simple de camélidos. En contraste con anticuerpos convencionales, camélidos anticuerpos están desprovistos de las cadenas ligeras y sólo contienen dos cadenas pesadas5. Por lo tanto, nanobodies son el más pequeño monomérica fragmentos de anticuerpos (12 kDa) capaces de unirse a un antígeno con una afinidad similar a la de anticuerpos convencionales6. Además, presentan mayor estabilidad y solubilidad en comparación con otros anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos. Por último, sus pequeños tamaños y sus extendidos lazos CDR3 les permiten reconocer epítopes crípticos y se unen a la enzima sitios activos7,8. Hoy en día, estos dominios están recibiendo considerable atención y se han combinado a la tecnología de biosensores. Por ejemplo, Huang et al. han desarrollado un biosensor basado en nanobody para la detección y cuantificación de antígeno específico de la próstata humana (PSA)9.
Como mencionado por encima, un parámetro importante en los ensayos de biosensor es la eficiencia del sistema utilizado para generar la señal eléctrica. Por esta razón, base enzimática biosensores electroquímicos han atraído cada vez más y se han utilizado ampliamente para diversas aplicaciones tales como salud, seguridad alimentaria y vigilancia del medio ambiente. Estos biosensores se basan en la hidrólisis catalítica de un substrato por una enzima para generar la señal eléctrica. En este contexto, β-lactamasas fueron demostrados para ser más específicos, más sensibles y fáciles de aplicar experimentalmente que muchas otras enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante10. Β-lactamasas son enzimas que son responsables de la resistencia bacteriana a los antibióticos β-lactámicos por les hidrolización. Son monoméricos, muy estable, eficiente y de pequeño tamaño. Por otra parte, las inserciones de dominio/péptido en β-lactamasas generan proteínas quiméricas bifuncional que mostraron ser eficientes herramientas para el estudio de las interacciones proteína-ligando. De hecho, estudios recientes han demostrado que la inserción de fragmentos variables de anticuerpos en los resultados de β-lactamasa TEM1 en una proteína quimérica que sigue siendo capaz de unirse con alta afinidad a su antígeno de la blanco. Curiosamente, el atascamiento del antígeno fue demostrado para inducir la regulación alostérica de la actividad catalítica de TEM111,12. Además, hemos demostrado en varios estudios que la inserción de dominio de proteína en forma permisiva de bucle de la β-lactamasa de Bacillus licheniformis BlaP genera proteínas quiméricas funcionales que se adaptan bien a monitorizar las interacciones proteína-ligando13 ,14. Recientemente hemos insertado un nanobody, denominado taxi-Lys3, en este sitio de inserción permisiva de BlaP15. Este nanobody fue demostrado para enlazar a la lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) y para inhibir su actividad enzimática16. Demostramos que la proteína híbrida generada, llamada BlaP-cAb-Lys3, conserva una especificidad alta / afinidad contra HEWL mientras que la actividad de β-lactamasa se mantuvo sin cambios. Luego con éxito combina la tecnología híbrida de β-lactamasa para un biosensor electroquímico y demostró que la cantidad de señal eléctrica generada era dependiente de la interacción entre BlaP-cAb-Lys3 y HEWL inmovilizada en un electrodo. De hecho, hidrólisis de β-lactámicos por BlaP inducen una liberación de protones que se puede convertir en una señal eléctrica cuantitativa. Esta combinación de la tecnología híbrida de β-lactamasa con un biosensor electroquímico es rápida, sensible y cuantitativo y permite la medición en tiempo real de la señal generada. Esta metodología se describe en este documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo presentamos un método para funcionalizar un nanobody utilizando la BlaP β-lactamasa como una proteína portadora y mostramos que podemos implementar con éxito la proteína híbrida resultante en un ensayo de sensor potenciométrico. El aspecto de innovación principal de nuestro trabajo en comparación con otros ensayos de biosensor es el acoplamiento covalente de la parte del anticuerpo a la actividad enzimática que genera la señal eléctrica. Esta tecnología de inserción de proteína llamada pres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la región valona de Bélgica en el marco de los proyectos de investigación SENSOTEM y NANOTIC, así como la nacional fondos para la investigación científica (F.R.S.-F.N.R.S) por su apoyo financiero.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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