In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.
Biosensoren zijn steeds belangrijk en toegepast op verschillende gebieden zoals pathogen detectie, moleculaire diagnostiek, milieumonitoring en veiligheid controle op levensmiddelen. In dit verband, we gebruikten β-lactamases als efficiënte verslaggever enzymen in verschillende eiwit-eiwit interactie studies. Bovendien is hun vermogen om te aanvaarden sterk inlassingen uit peptiden of gestructureerde eiwitten/domeinen stimuleert het gebruik van deze enzymen te genereren chimeer eiwitten. In een recente studie, wij in de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase een enkel domein antilichamen-fragment ingevoegd. Deze kleine domeinen, een afkorting voor nanobodies, worden gedefinieerd als de antigeen-bindende domeinen van één keten antilichamen van kameelachtigen. Als gemeenschappelijke dubbele keten antilichamen tonen ze hoog affiniteiten en specifieke kenmerken van hun doelstellingen. De daaruit resulterende chimeer eiwitten tentoongesteld een hoge affiniteit tegen haar doelstelling met behoud van de β-lactamase activiteit. Dit suggereert dat de nanobody en β-lactamase wordt blijven functioneren. In het huidige werk rapporteren we een gedetailleerd protocol dat β-lactamase onze hybridesysteem aan de biosensor technologie combineert. De specifieke binding van de nanobody aan zijn doel kan worden opgespoord dankzij een conductimetric meting van de protonen uitgebracht door de katalytische activiteit van het enzym.
Biosensoren zijn analytische apparaten die een bio-moleculaire interactie met fysische of chemische signalering apparaten die worden aangeduid als omvormers1combineren. De opgenomen signalen kunnen dan worden geïnterpreteerd en omgezet voor het controleren van de interacties tussen de geïmmobiliseerdet en gratis partners. Allermeest naar de biosensoren wordt gekenmerkt door het gebruik van een antilichaam te detecteren analyten zoals hormonen of andere ziekteverwekker markeringen2. Verschillende sensor indelingen kunnen worden gebruikt en massa-gebaseerde, magnetische, optische of elektrochemische biosensoren omvatten. De laatste behoren tot de meest gebruikte sensoren, en werkt door het omzetten van een bindende evenement in een elektrisch signaal. De voorstellingen en de gevoeligheden van alle antilichamen gebaseerde biosensoren zijn sterk afhankelijk van in wezen twee parameters: i) de kwaliteit van het antilichaam en ii) de eigenschappen van het systeem dat wordt gebruikt voor het genereren van het signaal-2.
Antilichamen zijn hoge-moleculaire massa dimeric eiwitten (150 – 160 kDa) dat uit twee zware kettingen en twee lichte kettingen bestaat. De interactie tussen de lichte en zware kettingen is meestal gestabiliseerd door hydrofobe interacties, alsmede een geconserveerde Zwavelbrug. Elke keten een variabele domein bevat dat met het antigeen in wezen via drie hypervariable regio’s met de naam aanvullende bepaling van regio’s (CDR1-2-3 samenwerkt). Ondanks de vele ontwikkelingen op het gebied, de grootschalige uitdrukking van full-length antilichamen met goedkope expressiesystemen (bijvoorbeeld E. coli) leidt vaak tot de productie van instabiele en geaggregeerde eiwitten. Dit is de reden waarom diverse fragmenten van antilichaam hebben ontworpen, zoals één-keten variabele fragmenten3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Zij bestaan uit de veranderlijke domeinen van respectievelijk één zware en een lichte kettingen die covalent gekoppeld zijn door een reeks synthetische aminozuur. Echter deze fragmenten vaak weer een slechte stabiliteit en hebben de neiging om statistische, aangezien zij een groot deel van hun hydrofobe regio’s het oplosmiddel4blootstellen. In dit verband één keten kameelachtige antilichaam fragmenten, hierna nanobodies of VHHs, lijken te zijn uitstekende alternatieven voor ScFvs. Deze domeinen komen overeen met de variabele domeinen van kameelachtige single-keten antilichamen. In tegenstelling tot conventionele antilichamen, kameelachtige antilichamen zijn verstoken van lichte kettingen en alleen bevatten twee zware kettingen5. Daarom zijn nanobodies de kleinste monomeer antilichaam fragmenten (12 kDa) kunnen binden aan een antigeen met een vergelijkbaar met die van conventionele antilichamen6affiniteit. Bovendien, bieden ze verbeterde stabiliteit en oplosbaarheid in vergelijking met andere full-length antilichamen of fragmenten van antilichaam. Ten slotte, hun kleine maten en hun uitgebreide CDR3 loops laten herkennen cryptische epitopes en een binding met het enzym actieve sites7,8. Tegenwoordig, deze domeinen zijn veel aandacht krijgt en aan de biosensor technologie zijn gecombineerd. Bijvoorbeeld, Huang et al.. hebben ontwikkeld een nanobody gebaseerde biosensor voor de detectie en kwantificering van menselijke prostaat-specifiek antigen (PSA)9.
Zoals vermeld hierboven is een belangrijke parameter in biosensor testen de efficiëntie van het systeem gebruikt voor het genereren van het elektrische signaal. Om deze reden, enzym gebaseerde elektrochemische biosensoren steeds aandacht hebben getrokken en hebben grote schaal gebruikt voor diverse toepassingen zoals gezondheidszorg, voedselveiligheid en milieubewaking. Deze biosensoren vertrouwen op de katalytische hydrolyse van een substraat door een enzym voor het genereren van het elektrische signaal. In dit verband werden β-lactamases meer specifieke, gevoeliger en gemakkelijker te implementeren dan vele andere enzymen zoals alkalisch fosfatase of horseradish peroxidase10experimenteel aangetoond. Β-lactamases zijn enzymen die verantwoordelijk voor bacteriële resistentie tegen β-lactam antibiotica zijn door hydrolyseerd hen. Ze zijn monomeer, zeer stabiel, efficiënt, en van klein formaat. Domein/peptide invoegingen in β-lactamases genereren bovendien, bi-functionele chimeer eiwitten die te zien waren als efficiënte tools aan studie eiwit-ligand interacties. Inderdaad, recente studies hebben aangetoond dat het invoegen van variabele fragmenten van antilichaam in de TEM1 β-lactamase resultaten in een chimeer eiwit dat blijft kunnen binden met hoge affiniteit aan haar doel-antigeen. Interessant, bleek de antigeen-bindende ertoe allosteric verordening van11,12van de katalytische activiteit van de TEM1. Bovendien toonden we in verschillende studies dat eiwit domein inbrengen in een tolerante lus van de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase functionele chimeer proteïnen toe die geschikt zijn produceert voor het controleren van de eiwit-ligand interacties13 ,14. We onlangs een nanobody, met de naam cAb-Lys3, in deze site tolerante invoeging van BlaP15ingevoegd. Deze nanobody werd getoond om te binden aan de kip-ei-wit lysozym (HEWL) en voor de remming van de enzymatische activiteit16. We toonden dat de gegenereerde hybride eiwit, genaamd BlaP-cAb-Lys3, een hoge specificiteit behouden / affiniteit tegen HEWL terwijl de β-lactamase activiteit bleef ongewijzigd. Dan zijn we met succes de hybride β-lactamase technologie om een elektrochemische biosensor gecombineerd en toonde aan dat de hoeveelheid gegenereerde elektrische signaal afhankelijk van de interactie tussen BlaP-cAb-Lys3 en HEWL op een elektrode geïmmobiliseerd was. Inderdaad, hydrolyse van β-lactam antibiotica door BlaP induceert een proton-release die kan worden omgezet in een kwantitatieve elektrisch signaal. Deze combinatie van de hybride β-lactamase technologie met een elektrochemische biosensor is snel, gevoelige, kwantitatieve en kunt real-time meting van het gegenereerde signaal. Deze methodologie wordt hierin beschreven.
Hierbij presenteren we een methode om functionalize van een nanobody met behulp van de β-lactamase BlaP als een drager-eiwit en we laten zien dat we de daaruit resulterende eiwitten hybride met succes in een potentiometrische sensor assay implementeren kunt. De belangrijkste vernieuwing aspect van ons werk in vergelijking met andere biosensor testen is de covalente koppeling van het antilichaam deel naar de enzymatische activiteit het elektrische signaal genereert. Deze zogenaamde eiwit invoeging technology presenteert …
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen het Waals Gewest in het kader van de onderzoeksprojecten SENSOTEM en NANOTIC alsmede de nationale middelen voor het wetenschappelijk onderzoek (FRS-F.N.R.S) voor hun financiële steun.
Reagents | |||
KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
Laboratory consumables | |||
6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
Equipment | |||
pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |