Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования
Summary
Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.
Abstract
Этот протокол описывает трехмерную биотрансляцию сердечной ткани без использования биоматериалов, используя только клетки. Кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты сначала выделяют, подсчитывают и смешивают при желательных соотношениях клеток. Они совместно культивируются в отдельных лунках в планшетах с ультра-низкой насадкой с 96 лунками. В течение 3 дней формируются бейбинг-сфероиды. Затем эти сфероиды подбирают с помощью вакуумного всасывания и собирают на игольчатой матрице с использованием 3D-биопринтера. Затем сфероидам разрешается сливаться с иглой. Через три дня после трехмерного биотрансляции сфероиды удаляются как неповрежденный патч, который уже спонтанно избивается. 3D-биотрансгированные сердечные патч демонстрируют механическую интеграцию компонентов сфероидов и являются многообещающими в регенерации сердечной ткани и в качестве трехмерных моделей сердечных заболеваний.
Introduction
Существует много разных методов 3D-биотрансляции 1 , 2 , 3 . 3D-биотрансляция часто классифицируется с помощью технологии печати 1 , например, с использованием биотрансформации для струйной печати, биопреобразования микроэкструзии, биопринтинга с использованием лазера, комбинации методов или более новых подходов. 3D-биотрансляция также может быть отнесена к незамерзающим или зависящим от леса методам 4 . Большинство методов 3D-биопринтинга являются зависимыми от лесов, где существует потребность в биоматериалах, например биоиндикаторах 5 или лесах 6 . Тем не менее, зависящий от лесов трехмерный биотрансляции сталкивается со многими проблемами и ограничениями 4 , 7 , такими как иммуногенность материала лесов, стоимость патентованных биоиндикаторов, низкая скорость и токсичность продуктов разложения.
ScafБыла предпринята попытка создания бессердечной кардиальной ткани с использованием сфероидов 8 с потенциалом преодоления этих недостатков инженерной инженерии, зависящей от лесов. Однако, как признали авторы в этой статье, было трудно надежно обрабатывать и позиционировать сфероиды в фиксированных местах в процессе биообработки. Сопутствующее использование 3D-биопреобразования и тканевой инженерии на основе сфероидов может преодолеть эти трудности. В этом протоколе мы описываем 3D-биотрансляцию сердечной ткани без других биоматериалов, используя только клетки в форме сфероидов.
3D-биопринтеры 9 на основе сфероидов, основанные на основах, имеют возможность подбирать отдельные сфероиды с помощью вакуумного отсоса и размещать их на игольчатой матрице. Концепция позиционирующих сфероидов на игольчатой матрице в 3D-биотрансляции основана на использовании игольчатых массивов (известных как « kenzan ») в древней ДжапеНежное искусство цветочной композиции, икебана. Эта система позволяет точно расположить сфероиды в любой конфигурации и приводит к тому, что отдельные сфероиды сплавляются вместе в течение короткого периода времени для создания трехмерной ткани с биотрансформацией. Таким образом, этот метод позволяет легко манипулировать сфероидами с потенциальными последствиями для будущего биообработки биомассы.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают следующие источники финансирования: Фонд Magic That Matters для сердечно-сосудистых исследований и Фонд исследований стволовых клеток штата Мэриленд (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
