Creazione di tessuto cardiaco che mostra l'integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D
Summary
Questo protocollo descrive la bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali. Le zone cardiache 3D bioprinted espongono l'integrazione meccanica dei sferoidi dei componenti e sono altamente promettenti nella rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli 3D di malattie cardiache.
Abstract
Questo protocollo descrive il bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali, utilizzando solo le cellule. I cardiomiociti, le cellule endoteliali ei fibroblasti vengono prima isolati, contati e mescolati a rapporti cellulari desiderati. Sono co-coltivati in singoli pozzetti in piastre a 96 pozzetti ad attacco ultra-basso. Entro 3 giorni, battendo forma sferoide. Questi sferoidi vengono quindi prelevati da un ugello usando l'aspirazione del vuoto e assemblati su un array di ago utilizzando un bioprinter 3D. I sferoidi sono quindi autorizzati a fondere sull'array dell'ago. Tre giorni dopo la bioprinting 3D, i sferoidi vengono rimossi come una patch intatta, che sta già battendo spontaneamente. Le zone cardiache 3D bioprinted espongono l'integrazione meccanica dei sferoidi dei componenti e sono altamente promettenti nella rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli 3D di malattie cardiache.
Introduction
Ci sono molti metodi differenti di bioprinting 3D 1 , 2 , 3 . La bioprinting 3D è spesso classificata dalla tecnologia di stampa 1 , con esempi come bioprinting a getto d'inchiostro, bioprinting a microestrusione, bioprinting assistito da laser, combinazione di metodi o approcci più recenti. La bioprinting 3D può essere classificata anche in metodi scaffold-dependent o scaffold-dependent 4 . La maggior parte dei metodi di bioprinting 3D sono dipendenti da scaffold, dove vi è la necessità di biomateriali, ad es. Biochip 5 o scaffold 6 . Tuttavia, il bioprinting 3D dipende da molte problematiche e limitazioni 4 , 7 , come l'immunogenicità del materiale di ponteggio, il costo dei biochimici proprietari, la velocità lenta e la tossicità dei prodotti di degradazione.
SCAFÈ stato tentato l'ingegnerizzazione dei tessuti cardiaci senza piombo usando sferoidi 8 , con il potenziale per superare questi svantaggi dell'ingegneria tissutale dipendente dal ponteggio. Tuttavia, come riconosciuto dagli autori in tale documento, era stato difficile gestire in modo robusto e posizionare sferoidi in posizioni fissi, nel processo di biofabbricazione. L'uso concomitante di bioprinting 3D e di ingegneria tissutale a base di sferoidi ha il potenziale per superare queste difficoltà. In questo protocollo, descriviamo la bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza altri biomateriali, usando solo le cellule sotto forma di sferoidi.
I bioprinters 3D a base di sferoidi a base di scaffali 9 hanno la capacità di prelevare singoli sferoidi usando l'aspirazione del vuoto e posizionarli su una matrice di ago. Il concetto di sferoidi di posizionamento su un array di ago in bioprinting 3D è ispirato dall'utilizzo di array d'ago (detto " kenzan ") nell'antico JapaSe l'arte della disposizione dei fiori, ikebana. Questo sistema permette che i sferoidali siano posizionati in modo preciso in qualsiasi configurazione e che i singoli sferoidi si fusero insieme per un breve periodo per creare un tessuto 3D bioprintato. Questo metodo consente quindi di manipolare con facilità le sferoidi, con potenziali implicazioni per il futuro della biofabbricazione degli organi senza scaffalature.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: Magic That Matters Fund per la ricerca cardiovascolare e il Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
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