Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

Summary

Este protocolo describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Abstract

Este protocolo describe 3D bioprinting de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales, utilizando sólo células. Los cardiomiocitos, las células endoteliales y los fibroblastos se aislan primero, se cuentan y se mezclan a las proporciones celulares deseadas. Se co-cultivan en pocillos individuales en placas de 96 pocillos de inserción ultrabaja. Dentro de 3 días, se forman esferoides. Estos esferoides son luego recogidos por una boquilla usando succión al vacío y montados en un conjunto de agujas usando una bioprinter 3D. A continuación se permite que los esferoides se fusionen en el conjunto de agujas. Tres días después de la bioprinting en 3D, los esferoides se eliminan como un parche intacto, que ya está espontáneamente golpeando. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Introduction

Hay muchos métodos diferentes de bioprinting 3D ^{1 , 2 , 3} . La bioprinting en 3D se clasifica frecuentemente por la tecnología de impresión ¹ , con ejemplos como bioprinting de inyección de tinta, bioprinting de microextrusión, bioprinting asistido por láser, una combinación de métodos o enfoques más recientes. 3D bioprinting también se puede clasificar en andamio libre o andamios métodos dependientes [ ^4] . La mayoría de los métodos de bioprinting 3D son dependientes de andamio, donde hay una necesidad de biomateriales, por ejemplo , bioinks ⁵ o andamios ⁶ . Sin embargo, la bioprintura en 3D dependiente del andamio se enfrenta a muchos problemas y limitaciones ^{4 , 7} , tales como la inmunogenicidad del material de andamiaje, el costo de los bioinks patentados, la velocidad lenta y la toxicidad de los productos de degradación.

EscaleraSe ha intentado una ingeniería de tejido cardíaco sin pliegues utilizando esferoides ⁸ , con el potencial de superar estas desventajas de la ingeniería tisular dependiente del andamio. Sin embargo, como reconocen los autores en ese trabajo, ha sido difícil manipular y colocar con firmeza los esferoides en lugares fijos, en el proceso de biofabricación. El uso concomitante de bioprinting 3D y la ingeniería de tejidos basada en esferoides tiene el potencial para superar estas dificultades. En este protocolo, se describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin otros biomateriales, utilizando sólo las células en forma de esferoides.

Las bioprintadoras 3D basadas en esferoides libres de andamios tienen la capacidad de recoger los esferoides individuales usando succión por vacío y colocarlos en un conjunto de agujas. El concepto de posicionamiento de los esferoides en una matriz de agujas en bioprintado 3D, se inspira en el uso de los conjuntos de agujas (conocidos como " kenzan ") en el antiguo JapaArte nese del arreglo de la flor, ikebana. Este sistema permite que los esferoides se posicionen con precisión en cualquier configuración y da como resultado que los esferoides individuales se fusionen durante un período corto para crear un tejido 3D bioprinted. Este método permite, por lo tanto, manipular los esferoides con facilidad, con implicaciones potenciales para el futuro de la biofabricación de órganos libre de scaffold.

Protocol

1. Preparación de cardiomiocitos Generar y cultivar células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) en placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal como se describe 10 . Diferenciar hiPSCs hiPSC derivados de cardiomiocitos (hiPSC-CMs) utilizando los métodos descritos anteriormente [ 11 , 12] . El día 19 después de la diferenciación, aísle los cardiomiocitos usando 2 ml de t…

Representative Results

Al final del paso 4.4 (co-cultivo), las células de cada pocillo deben agregarse en la parte inferior de las placas de 96 pocillos de fondo en U de inserción ultrabaja para formar esferoides por gravedad. Estos esferoides contienen hiPSC-CM, HCFs y HUVECs, y pueden ser inspeccionados visualmente bajo microscopía óptica, donde deben aparecer circulares por proyección bidimensional ( Figura 1 ). Al final del paso 6.3, el parche cardiaco bioprinted en 3D de…

Discussion

It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.

One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…

Materials

Geltrex	Invitrogen	A1413202
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher	15400054
Defined Trypsin inhibitor 0.0125%	Thermo Fisher	R007100
RPMI Cell Media	Invitrogen	11875-093	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
B-27 Supplement	Thermo Fisher	17504044	RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type)	Sciencell	6310
Human umbilical vein endothelial cells	Lonza	CC-2935
PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates	Akita Sumitomo Bakelite Co.	MS-9096UZ
Regenova Bio 3D Printer	Cyfuse Biomedical K.K.	N/A	www.cyfusebio.com/en/
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Troponin T Antibody	Thermo Fisher	701620
Connexin 43 (Cx43) Antibody	Chemicon	MAB3068
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher	P36935