Summary
Viral-derived peptider kopplade till antikropp-konjugat (ACs) är en metod att få fart på grund av potentialen för att leverera molekylär nyttolaster med ökad tumör cell ackumulering. Detta protokoll utnyttja gemensamma metoder för att utvärdera peptid konjugation, AC och nyttolast intracellulär ackumulation och tumör inriktning, och hjälper forskare under de viktiga första utvecklingsfaserna.
Abstract
Antikropp-konjugat (ACs) modifierad med virus-derived peptider är en potentiellt kraftfulla klass av tumör cell leverans agenter för molekylär nyttolaster används vid cancerbehandling och imaging på grund av ökad cellulär ackumuleras över nuvarande ACs. Under tidiga AC in vitro- är utveckling, fluorescens tekniker och radioimmunoassays tillräckliga för att fastställa intracellulära lokalisering, ackumulering effektivitet och målet cellen specificitet. För närvarande finns det ingen konsensus om standardiserade metoder för att förbereda celler för att utvärdera AC intracellulär ackumulation och lokalisering. Den ursprungliga testning av ACs modifierad med virus-derived peptider är avgörande speciellt om flera kandidater har byggts. Att bestämma intracellulär ansamling av fluorescens kan påverkas av bakgrund signal från ACs på cellytan och komplicera tolkningen av ackumulering. För radioimmunoassays, vanligtvis behandlade cellerna är fractionated och radioaktiviteten i olika cell fack mätt. Dock cellys varierar från cell till cell och ofta kärnvapen och cytoplasmiska fack är inte tillräckligt isolerade. Detta kan ge missvisande uppgifter om nyttolast leverans egenskaper. Intravenös injektion av radiomärkt virus-derived peptid-modifierade ACs i tumör med möss följt av radionuklid imaging är en kraftfull metod för att bestämma tumör inriktning och nyttolast leverans egenskaper på den in-vivo -fasen av utveckling. Men detta är en relativt ny avancemang och några grupper har utvärderat virus-derived peptid-modifierade ACs på detta sätt. Vi beskriver behandlingen av behandlade cellerna att mer exakt bedöma virus-derived peptid-modifierade AC ackumulering när du använder konfokalmikroskopi och radioimmunoassays. Specifikt, bunden en metod för trypsinizing celler bort cellytan ACs. Vi ger också en metod för att förbättra cellulär fraktionering. Slutligen ger detta protokoll en in-vivo -Metod med hjälp av positronemissionstomografi (PET) för att utvärdera inledande tumör inriktning boenden i tumör-bärande möss. Vi använder den radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som ett exempel nyttolast i detta protokoll.
Introduction
Antikropp-konjugat (ACs) är biologiska läkemedel som mognar till en omvälvande klass av effektiva läkemedel för att förbättra cancerbehandlingar och för att upptäcka tumörer. Består av en monoklonal antikropp (mAb) konjugerat till molekylär nyttolaster som radioisotoper, små molekyler och biologiska gifter, ACs kan leverera dessa nyttolaster till cancerceller med utsökta mål antigen affinitet och specificitet. ACs har därmed potential att avsevärt minska ospecifik toxicitet och ökar nyttolasten aktivitet på webbplatsen tumören. Terapeutiskt, har ACs transporterar cytotoxiska små molekyler (vanligen kallat antikropp-drogen konjugat) godkänts för behandling av patienter med bröstcancer och Hodgkins lymfom som har misslyckats med konventionella behandlingar 1, 2. Dessutom ACs transporterar radioisotoper (ofta kallad radioimmunoconjugates) är också under utveckling. En AC som transporterar en radioisotoper för avbildning är godkänd för att identifiera prostatacancer metastaser 3. Med många mer terapeutiska ACs inskickad för godkännande 4, är optimismen hög för framtiden för ACs att förbättra cancer care 5.
Ändå när leverera kemoterapeutika eller radioisotoper, ACs har svårigheter att effektivt ackumulera dessa nyttolaster inuti målceller. Denna aspekt bidrar avsevärt i många fall i oförmågan av ACs att ge långvarig överlevnad eller hög kontrast tumör imaging 6,7. I allmänhet när ACs binda deras mål antigen är de internaliserat genom en process som kallas receptormedierad endocytos. ACs är sedan anhållna inuti endosomes och människohandel till lysosomer för nedbrytning och nyttolast release 8. Intracellulära människohandel processen innebär utmaningar för ACs att uppnå en hög nyttolast specificitet och effekten mot cancer målceller. Exempelvis många antigener såsom Her2 (mål för terapeutiska AC Trastuzumab-emtansin) kan återvinna upp till 85% av bundna antikroppar i första 30 min 9. Dessutom när nedbrytningen sker, kan släppt kemoterapeutika och radioisotoper aktivt exporteras genom ökat uttryck eller aktivitet av membran associerade transport proteiner 10,11. Lysosomen nedbrytning hindrar också leverans av romanen biologiska nyttolaster såsom terapeutiska enzymer och oligonukleotider som kan avaktiveras 12,13. I huvudsak är cancercellen mycket effektivt på om upphävande av nödvändiga intracellulära ackumuleringen av nyttolaster levereras av ACs.
Det här protokollet beskriver hur du implementerar begreppet ACs-kopplat till virus-derived peptider, speciellt för fly endosome brottsprovokation och lokalisera till cellkärnan. Med sådan finess att manipulera cell värdsystem, är det inte förvånande att utvecklingen av virus-derived proteiner och peptider som potentiella biologiska läkemedel har länge varit ingrodd i terapeutisk forskning 14. Under miljontals år utvecklats virus för att förvärva en enastående samling av proteiner kan utnyttja normala fysiologiska däggdjursceller system för att effektivt ange värdceller. För virus som är internaliserad via receptormedierad endocytos, ifrågasätts de också utströmmande människohandel till Lysosomen där angrepp av en lokaliserad koncentration av proteaser kan vara problematiskt för överlevnad. En väl karakteriserade viral-derived peptid som utnyttjas i drogen leverans för flyr endosome entrapment är humant immunbristvirus transactivator transkription (Tat) protein 15. Tat är kunna fly endosome entrapment av avkänning låg-pH då protein konfirmerande förändringar inträffar möjliggörande Tat för att sätta sig in och störa den endosomal membran 16. Detta resulterar i Tat-nyttolast konjugat komma åt cytoplasman. Elementet för andra virala manipulation som relaterade till detta protokoll är det synsätt som används för att leverera terapeutiska gener och droger till nucleus 17. Virus har utvecklats framgångsrikt manipulera värd cell maskiner för framåt förbi det nukleära membranet genom att passera genom kärnkraft pore komplexa (NPC). Cellulära makromolekyler innehåller (eller binda till proteiner som innehåller) cellkärnelokalisering signaler (NLSs) nödvändiga för att binda till nukleära transport proteiner (t.ex. karyopherins α och β), som ger de nödvändiga rörelserna genom NPC. Virus har utvecklat proteiner innehåller NLS sekvenser som ger dem möjlighet att utnyttja värd cell transportproteiner för shuttling i nucleus 18.
Många ACs har tidigare functionalized med Tat - och NLS-härledda peptider och testats för deras förmåga att ackumulera inuti cancerceller och inriktning tumörer 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabell 1). Studier att leverera cytotoxiska nyttolaster har visat att ACs modifierad med virus-derived peptider har möjlighet att avsevärt öka cellulära ackumulering, cytotoxicitet och tumör döda över omodifierade ACS- 22,26. Ett gemensamt drag för denna nya klass av AC är deras konstruktion. Normalt innehåller peptider en terminal cystein som tillhandahåller en gratis sulfhydryl-grupp. MAbs är först reagerade med en noncleavable bifunktionell crosslinker som innehåller N- hydroxysuccinimide (NHS) och maleimide grupper i motsatta ändar. NHS estrar reagerar med primära aminer i mAb att bilda amide obligationer. De reagerade mAb med gratis maleimide grupper är då reagerade med sulfhydryl grupper på peptiderna bilda en thioester bond och därmed länka peptid och mAb. Även om homobifunctional bindemedel används 28, heterobifunctional crosslinker är mer allmänt används i byggandet av virus-derived peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Detta protokoll speciellt använder den crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-bildas (sulfo-SMCC) för dess användarvänlighet och eftersom det används i den godkända antikropp-drogen konjugat Trastuzumab-emtansin och i många virus-derived peptid-ACS- 8,22,23,26,31,32. Sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) är den primära metoden för att inledningsvis fastställa konjugation effektivitet och semi kvantifiera antalet peptider per mAb. Konfokalmikroskopi använder en fluorescently-märkt sekundär antikropp specifik för mAb är vanligtvis metoden för att initialt bedöma intracellulär distribution egenskaperna för virus-derived peptid-modifierade ACs. Hittills har är radioisotoper de primära nyttolaster levereras av virus-derived peptid-modifierade ACs. Radioisotoper är fördelaktigt eftersom radioaktivitet i celler enkelt kvantifieras genom gamma räkning. Dessutom ACs som översätts till musmodeller av mänskliga cancerformer ger forskare möjlighet att utvärdera tumör inriktning med molekylär avbildningsmetoder såsom single photon emission beräknade datortomografi och positronemissionstomografi (PET) 23 , 32 , 33. I allmänhet konstruktion och validering testmetoder används främst av forskare ge en mycket bra bedömning av ACs modifierad med virus-derived peptider under inledande utvecklingsarbetet för att effektivt komma in och leverera den nyttolast inuti målceller och till målet tumörer.
Tat och NLS-modifierade ACs har belyst nyckelområden för att ytterligare förbättra nyttolast leverans inuti cancerceller och tumörer. När det gäller NLS-modifierade ACs, kan effektiviteten i intracellulär ansamling vara blygsamma 23,31,34. Ineffektiva intracellulär ansamling orsakas av fortsatt endosomal entrapment. In vivo tumör inriktning kan också minskas med båda Tat och NLS-modifierade ACs. Den aktiva sekvenser av Tat och NLS innehålla flera positivt laddade rester. När bifogas mAbs, vara övergripande katjoniska avgiften betydligt ökad 35. Som en följd har den Tat och NLS-modifierade ACs ökat upptag i friska vävnader och ökade snabbt blod clearance.
Vår grupp utvecklat en sammansatt förening bestående av cholsyra kopplade till NLS (ChAcNLS; (Se figur 1). ChAcNLS modifierade ACs kan öka intracellulära ackumuleringen av levererade radioisotoper och förbättra tumör inriktning jämfört med NLS-modifierat och traditionella ACs 33,34. Mekanismen bakom cholsyra är inspirerad av förmågan hos utvalda nonenveloped virus som inte kan åberopa membran fusion att utnyttja cholsyra för att utlösa endosome fly genom bildandet av ceramide. Exempelvis rekryterar svin enteriska virus cholsyra som aktiverar sphingomyelinase, katalyserar hydrolys av ceramidas in ceramide 36,37,38. Detta gör virus att fly och destabiliserar endosomal membran. Cholsyra är alltså en annan virus-derived komponent som kompletterar NLS.
När fältet rör sig framåt och framtida uppstår framsteg i nyttolast leverans av ACs modifierad med virus-derived peptider, är det ett lämpligt tillfälle att ge visuella demonstrationer av deras biokemiska och funktionella egenskaper under första utveckling. Här beskriver vi våra protokoll för den inledande utvärderingen av virus-derived peptid-modifierade ACs för effektiva och ändå enkel bestämning av intracellulär ackumulation och tumör inriktning under tidiga utvecklingsfaserna. Vi använder kommersiellt tillgängliga mAbs 7 g 3 och A14 som exempel modellsystem. Procedur 1 beskriver användningen av SDS-PAGE som en metod som möjliggör för ' go/no go' beslut för konstruerade ACs. 2 beskrivs en metod med trypsinization möjliggör förbättrad visualisering av AC intracellulär distribution och ackumulering. 3 beskrivs en metod för förbättrad intracellulära fraktionering att noggrant bestämma cellkärnelokalisering. I den här proceduren använder vi den payload 64Cu (t1/2 = 12,7 h) eftersom den är sårbara för cellulära efflux och är en positron emitter 10. Således, procedur 4 beskriver i vivo tumör inriktning karakterisering av PET imaging för att visualisera tumören upptag i förhållande till bakgrunden (dvs ickemålorganismer friska vävnader) och avgöra huruvida exemplet AC kan specifikt och effektivt målet tumörer. Dessa metoder är tillräckliga för utredarna utveckla ACs modifierad med virus-derived peptider för att identifiera kandidater för vidare avancemang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De i vivo djurförsök beskrivs utfördes enligt ett godkänt protokoll och de etiska riktlinjerna Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etikkommitténs för djur experiment.
1. antikropp peptid konjugation
Obs: ChAcNLS kan syntetiseras på kommersiella peptid tillverkare eller universitet-anslutna peptid syntes serviceplattform. Syntesen av ChAcNLS kan hittas i referens 34. För förfaranden 1 och 2 använda mAb 7 g 3, som är specifik för leukemi antigenet IL-3Rα 39.
- I ett 1,7 mL mikrocentrifug rör, Bered en 10 mg/mL (~ 1 mg totala antikropp) 7 g 3 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,6.
- Lös upp sulfo-SMCC i dimetyl sulfoxid (DMSO) vid en koncentration på 5-10 mM. Vortexa lösningen fungerar noggrant bäst för att uppnå fullständig upplösning.
- Tillsätt till röret som innehåller 7 g 3 upplöst sulfo-SMCC lösningen (normalt mellan 5-20 μL beroende på molar förhållandet av sulfo-SMCC-till - 7 g 3 önskas). Testning sulfo-SMCC-till - 7 g 3 nyckeltal 10-, 25-och 50-till-1 rekommenderas. Odla i rumstemperatur för 1 h.
-
Rena och koncentrera sig på maleimide-derivatized 7 g 3 med hjälp av ultrafiltrering enhet och buffert utbyte i PBS, pH 7,0. Centrifugera vid 8000 x g för ca 5 min. kasta flödet genom och fylla med PBS, pH 7,0 och centrifugera igen.
- Utföra detta 7 - 8 gånger att helt byta bufferten. Återvinna den koncentrera 7 g-3 protein genom att placera filtret enheten upp och ned i en ren mikrocentrifug rör. Centrifugera under 2 minuter vid 1000 x g. återställningsvolym bör vara cirka 0,3 mL
- I röret som innehåller de maleimide-aktiverat 7 g 3, Lägg till 2-faldigt molar överskott av ChAcNLS i förhållande till sulfo-SMCC-till - 7 g 3 förhållandet används i föregående steg och inkubera över natten vid 4 ° C. Till exempel om förhållandet 10: 1-sulfo-SMCC-till - 7 g 3 användes, sedan använda förhållandet 20: 1-ChAcNLS-till - 7 g 3. Totala volymen bör inte ändras väsentligt.
Obs: Även om ChAcNLS inte orsakar nederbörd under processen konjugation detta är en möjlighet som kan inträffa med andra peptider. Iaktta röret under reaktionen för tecken av nederbörd, som troligen uppstår när peptider är hydrofoba. I dessa fall kan det vara värt återbesök peptiden av intresse för utformning ändras för att tillhandahålla ökad hydrophilicitet. - Koncentrera sig på 7G 3-ChAcNLS med en ultrafiltrering enhet till önskad koncentration och buffert exchange i PBS pH 7,4 (se steg 1.4). Återhämtning avkastningen av totala protein bör vara ≥ 75% av den ursprungliga utgångsmaterialen.
- Utföra SDS-PAGE för att utvärdera de konstruera 7G 3-ChAcNLS kandidater med en 12% polyakrylamidgel (ger tillräcklig separation av ChAcNLS konjugerat tunga och lätta kedjor från nonconjugated kedjor). Blanda 10 μg av 7G 3-ChAcNLS i sidan laddas buffert innehållande 2 μL β-merkaptoetanol och ladda in väl.
- Ställa lämpliga spänningen (120 V för 1 h för en 12% gel) och köra elektrofores. Stoppa elektrofores när Coomassie dye framdel når botten av gelen.
Obs: Låt inte Coomassie dye framsidan springa bort gelen. - Ta bort gel elektrofores apparatens och skölj med avfärgning lösning innehållande 10% v/v isättika och 20% v/v metanol.
- Ta ett foto av gel och med en linjal och mät avståndet (cm) migreras för normerna och 7 g 3 konjugat. Beräkna värdet bibehållande faktor (Rf), vilket är avståndet migreras delas av gel längd (från där protein lastas på Coomassie migration framsidan). Rita molekylvikt (MW) i loggen mot RF-värdena från varje protein som standard och extrapolera storleken av 7 g 3 konjugat.
- Beräkna antalet peptider per antikropp genom att dividera skillnaden i MW mellan 7 g 3 konjugat och omodifierade 7 g 3 av 1768.5 g/mol (MW av ChAcNLS).
- Ta digitala bilder av Coomassie-färgade gel och utföra densitometry analys. Vid denna punkt, kan valet av en bly-kandidat baseras på AC med det maximala antalet ChAcNLS molekyler som inte innehåller betydande sammanlagda arter.
2. konfokalmikroskopi för intracellulär ansamling utvärdering
Obs: Det är viktigt att testa cell selektivitet intracellulär ansamling av den peptid-modifierade mAbs före utveckla formuleringar med en nyttolast av intresse. Eftersom Tat har också visat sig ha en benägenhet för ospecifik cell penetration, är det värt första analysera intracellulär ackumulation och cell selektivitet innan företaget kostsam utveckling steg med dyra nyttolaster. Av denna anledning bör förfarande 1 också ändra isotypen specifik irrelevant kontroll mAbs. För resten av protokollet kommer vi arbeta med ACs modifierad med 10 ChAcNLS molekyler per antikropp. I figur 2beskrivs en schematisk inklusive viktiga steg för förfaranden 2 och 3.
Varning: Detta steg av protokollet innebär hantering och manipulering av PARAFORMALDEHYD. Följ tillverkarens instruktioner vid hantering.
- Behandla målceller TF-1a med 200 nM 7G 3-ChAcNLS inklusive modified kontroll mAbs. Inkubera 5 x 106 antigen-positiva celler med konjugatet för 1 h vid 37 ° C.
- Efter 1 h, avlägsna supernatanten och tvätta med 1 mL 3 x i iskall PBS. Tillsätt färska media och inkubera i en extra timme vid 37 ° C.
-
Efter ytterligare timme, avlägsna supernatanten och tvätta 3 x i 1 mL iskallt PBS. Lägg till 0,5 mL PBS som innehåller 0,25% trypsin och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid 37 ° C för 3 upp till 30 min.
Obs: Under inledande pilot testning rekommenderas det att inte trypsinize celler för att avgöra skillnaderna i AC intracellulär ackumulation. Detta protokoll främjar användningen av trypsin och vi visar hur detta förbättrar bedömning av intracellulära ackumuleringen effektiviteten av olika AC kandidater.- Testa olika tider för inkubation genom att visuellt kontrollera alla celler som lossnat. Dessutom, inkubera cell alikvoter med livskraft färgning lösningar och utföra flöde flödescytometrisk analys som tidigare beskrivits 40.
- Neutralisera trypsin med 1,5 mL cellkultur RPMI 1640 media/10% fetalt bovint serum. Centrifugera celler vid 500 x g i 5 min, ta bort supernatanten och tvätta 3 x i 0,5 mL iskallt PBS.
- Reparation av celler i 0,5 mL PBS med 1% PARAFORMALDEHYD och 1% sackaros på is för 30 min. Tvätta cellerna 3 x i 0,5 mL iskallt PBS och centrifugera vid 250 x g för 5 min. Permeabilize celler i 0,5 mL PBS som innehåller 0,15% Triton x-100 för 5 min på is. Tvätta cellerna i iskall PBS och upprepa centrifugering.
-
Avbryta celler i 0,1 mL PBS som innehåller 2 μg/mL (eller tillverkaren rekommenderat koncentration) av en mot murint (isotyp specifika) Fc sekundära polyklonal antikropp konjugerat till AlexaFluor 647 för 1 h i rumstemperatur i mörkret.
- Centrifugera vid 250 x g i 5 min och tvätta cellerna 3 x i 0,5 mL iskallt PBS. Avbryta celler i 0,5 mL PBS.
PAUS: Celler kan förvaras i kylskåp.
Obs: Det är väsentligt att man väljer en sekundär antikropp som känner igen de rätta isotypen av mAb av intresse. AF647 väljs på grund av dess infraröd utsläpp, som inte stör propidium jodid (PI) färgning av kärnan.
- Centrifugera vid 250 x g i 5 min och tvätta cellerna 3 x i 0,5 mL iskallt PBS. Avbryta celler i 0,5 mL PBS.
- Lägg till PI i en koncentration på 10 μg/mL till behållaren med celler. Nästa, montera 1 x 105 celler på objektglas med montering media och täck med ett täckglas.
- Undersöka celler med en planera Apo 60 X oljeimmersionsobjektivet NA 1,42 på en inverterad laserscanning confocal mikroskopet. Upptäcka PI fluorescens med 488 nm argon laser och spektrala skanning Prisma för 600-650 nm. För AF647 använder fluorescens 633 nm helium-neon laser och spektrala skanning Prisma för 650-700 nm. Samla in fluorescens utsläpp från PI och AF647 sekventiellt.
Obs: Använd samma inställning under hela utvärdering och jämförelse av cellerna. Dock kommer du behöva justera inställningarna för trypsinized celler jämfört med icke-trypsinized celler. - Använda Mikroskop mjukvaran för att förvärva bilder. Samla bilder med seriell horisontella optiska delar av 1 024 x 1 024 pixlar med 2 X line genomsnitt tagna med 0,5 μm intervaller genom hela cellen tjockleken. Presentera bilderna så staplade z-prognoser från fyra på varandra följande segment på maximal fluorescensintensiteten.
- Analysera celler med Mikroskop mjukvaran. Registrera den cellulära spridningsbild av konjugat. Specifikt, bedöma om intracellulära fluorescens i cytoplasman är grupperade och nära cellen ytbehandlar eller diffus och homogen. Även utvärdera relativ fluorescensintensiteten per cell.
3. radioaktivt AC konstruktion och cellulära fraktionering för utvärdering av 64 Cu intracellulära leverans effektivitet
FÖRSIKTIGHET: Förfaranden 3 och 4 omfattar hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg, borde forskare ha godkänd säkerhetsutbildning och protokoll som godkänts från deras hem institutets Strålsäkerhetsmyndigheten.
Obs: För förfaranden 3 och 4 använder vi mAb A14, som är specifik för invasive urinblåsan cancer antigenet IL-5Rα41. Alla experiment är också tid känsliga på grund av den korta halveringstiden för 64Cu. I allmänhet är det bäst att inte vänta senaste 1 veckan att utföra i vitro experiment och inte längre än 72 h för in-vivo studier.
- På 1,7 mL tub avbryta 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic syra (NOTA-NHS) i DMSO till en koncentration av 10 mM.
- Reagera 50-faldig molar överskott av NOTA-NHS med A14 (2 mg utgångsmaterial) 0,1 M natriumvätekarbonat vid pH 8,6 för 1 h i rumstemperatur i en volym ≤ 0,5 mL (den slutliga NOTA-NHS-volymen inte bör överstiga 2% v/v i total volym).
- Rena och buffert-exchange NOTA-A14 med en ultrafiltrering enhet i PBS, pH 7,6 (se steg 1.4).
- Vid efterföljande fastsättning av ChAcNLS, Följ steg 1.2-1.6.
- Reagerar NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg batchar) med 100 som (MBq) 64CuCl2 0,1 M natriumvätekarbonat, pH 5,5 för 1 h vid 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu är producerad på den TR-PET cyklotron på CIMS 42.
- Koncentrera sig 64Cu-A14-ChAcNLS i PBS pH 7,4 med en ultrafiltrering enhet till önskad koncentration (se steg 1.4).
-
Bestämma radiolabeling effektiviteten av 64Cu-A14-ChAcNLS av omedelbar tunnskiktskromatografi (ITLC) med hjälp av kromatografi strips och 0,1 M, pH 5,5 natriumcitrat (ITLC eluenten) som lösningsmedel. Gälla den ITLC strippen 0,5 μl alikvot av lösningen reaktion. Utföra en autoradiograph av remsan och få en digital bild.
- Utföra densitometry för att få andelen bundna och fria 64Cu. Om gratis 64Cu innehållet är > 5%, tillbaka till föregående steg och utföra ytterligare rening.
- Dessutom utför SDS-PAGE med Coomassie färgning för att utvärdera aggregeringar. Utföra en andra SDS-PAGE följt av en autoradiograph av gel för att avgöra om det finns radioaktivt märkt sammanlagda arter.
-
Affinitet bindande kvalitet checkpunkt: Inkubera 64Cu-A14 konjugat på ökande koncentrationer (0-100 nM) i två exemplar med 1 x 106 målceller per mL. Att beräkna ospecifik bindning, blanda dubbla prover av 64Cu-A14 konjugat med celler i närvaro av 100-faldig molar överskott av omärkta A14.
- Efter 1 h inkubation på is, tvätta cellerna och räkna totala bundna antikroppar prover och totala ospecifik bundna antikroppar prover i en gamma räknare. Diagram specifik bindning (totala bundna antikroppar - ospecifik bundna antikroppar) mot reaktiva gratis 64Cu-A14 (nM) används i analysen. Bestäm konstanten dissociation (Kd) genom nonlinear regression med hjälp av grafritande programvara.
- För 64Cu cellulära ackumulering studier: behandla celler med 100 nM av 64Cu-märkt A14 konjugat för 1 h, 6 h, och 24 h vid 37 ° C som tidigare beskrivs33. Inkludera ytterligare parametrar såsom behandling i närvaro av oförändrad A14 att blockera IL-5Rα siter och vid 4 ° C att blockera receptor-medierad internalisering.
- Vid tidpunkten för definierade punkter, som tidigare beskrivits i steg 2,3 - 2.3.2, tillsätt 0,5 mL PBS som innehåller 0,25% trypsin och EDTA vid 37 ° C följt av neutralisering och tvätt.
- Inkubera cellerna i plasmamembranet lyseringsbuffert innehållande 1% NP-40, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 buffert på is för 10 min. Centrifugera plasmamembran-lyserat cellerna vid 90 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och placera i färska tube. Detta representerar cytoplasmiska bråkdel. Tvätta kärnorna 3 x i iskall PBS och lägga till tvättar den cytoplasmiska fraktionen.
- Säkerställa injektionsflaskor innehållande de nukleära och cytoplasmiska fraktionerna är förseglade. Placera dem sedan i en gamma counter kalibrerat för 64Cu för att konvertera raw räknas till MBq.
-
Bestämma kvaliteten på kärnor isolering genom att utföra Western blot analys för Lamin A/C, en begränsad nukleära protein och Rab7, en riklig cytoplasma protein på hela cell lysate, nuclear och cytoplasmiska fraktioner.
- Behandla 5 x 106 celler med 500 μL analysbuffert för radio-immunoprecipitation (RIPA) och de plasmamembran lyseringsbuffert i steg 3,12 innehållande 1%, 2% och 4% NP-40. Dessutom behandla isolerade atomkärnor i 500 μL av RIPA bufferten att erhålla isolerade nukleära proteiner.
- Fällningen isolerade kärnvapen, cytoplasmiska och hela cellproteiner med 4 x provvolymen kalla aceton för 60 min vid-20 ° C. Centrifugera vid 13 000 x g i 10 min och Dekantera supernatanten försiktigt så att inte rubba protein pelleten. Tillsätt 100 μL av PBS att upplösa proteiner.
- Belastning 10 μg av protein i varje brunn en 10% SDS-PAGE gel. Utför elektrofores som beskrivs i 1,7-1,9. Utföra Western Blot överföring som tidigare beskrivits i refeference 43.
- Identifiera stegen markörer som bäst motsvarar en MW ~ 40 kDa. Halvera membranet på denna markör. PROBE blot som innehåller högre MW proteinerna med Lamin A/C-specifika antikroppar. PROBE membranet med lägre MW proteinerna med Rab 7-specifika antikroppar. Western blot är en välkänd teknik och beskrivs inte i detta protokoll.
4. PET Imaging utvärdering av tumör inriktning
Obs: Teknikerna av implantation av tumörceller i möss att generera heterotopisk xenograft är väl kända och de flesta laboratorier har internt protokoll skräddarsydd för deras tumör system. Detta omfattas således inte i protokollet. Xenograft modellen blir nonobese diabetiker/svår kombinerad nedsatt immunförsvar (nicka/SCID) möss med IL-5Rα-positiva invasive urinblåsan tumörer HT-1376 och HT-B9. IL-5Rα-positiva invasive urinblåsan tumörceller omfatta > 66% av totala celler i xenograft. Däremot fanns endast ~ 11% av IL-5Rα-positiva HT-B9 celler i utvecklade xenograft41. Denna modell ger därmed ett utmärkt exempel för att utvärdera AC tumör inriktning i två tumörer som representerar förutsebara patientens tumör heterogenitet.
- I grupper som innehåller ≥ injicera 4 (nicka/SCID) möss, 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS och 64Cu-A14 svans venen.
- Placera en cylindrisk phantom (24,8 mL) som innehåller 5 MBq 64Cu konvertera radioaktiva räkningarna per sekund till injicerade dosen per gram vävnad (%ID/g) samma dag.
- Vänta 48 h och sedan söva möss genom att placera dem i en induktion kammare med 1,5 L/min syre flöde med 2% isofluran. Applicera sterila oftalmologiska salva till mus ögon efter induktion och innan placering i PET-kamera.
- Snabbt flytta musen till en PET-kamera tabell i headfirst liggande position med en Kona för isofluran. Ställning respirationen och rektal sonder och övervaka temperatur och respiration klassar till säkerställa att fysiologiska förhållanden bibehålls under experimentet som tidigare beskrivs 44.
- Starta PET dataförvärvet använder en inställning för regelbunden provtagning-läge och ett energifönster av 250-650 keV. En 45 minuters statiska scan per mus är vanligtvis tillräckligt för att ge tillräcklig sammanfallande händelser för återuppbyggnad och produktion av hög kvalitet PET-bilder.
- Efter 64Cu-AC genomsökningen, ta bort musen från skannern och placera den tillbaka i buren. Möjliggöra musen tillräckligt återställa innan han återvände till djuranläggningen.
- Erhålla rekonstruerade bilder med hjälp av 20 upprepningar av en tredimensionell högsta sannolikheten förväntan maximering algoritm.
-
Utföra regionen av intresse (ROI) analys av tumören och visuellt taxeringsbart organ med programvaran AMIDE.
- Rita ROIs för att erhålla kvantitativa %ID/g data manuellt med inställningen 3D Freehand verktyg och noggrant beskriva tumörer eller intilliggande lårmuskeln. Räkningarna per pixel i ROI kommer att konverteras till %ID/g från föregående steg 4,2.
- Jämföra 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS bilder för tumör kontrast, och kvantitativa ROI % ID/g och tumör till bakgrunden nyckeltal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För procedur 1 modifierad byggandet av 7 g 3 med ChAcNLS använda sulfo-SMCC som en crosslinker är mycket pålitlig. Vanligtvis när lastas en 12% gel och analyseras av SDS-PAGE, detta resulterar i en urskiljbar stegvis ökning MW proportionell mot ökande sulfo-SMCC-till - 7 g 3 nyckeltal används och möjliggör de tunga och lätta kedjorna bedömas individuellt för ChAcNLS konjugering (figur 3). 7G 3 reagerade på 10-, 20-, 25- och 50-till-1 sulfo-SMCC-till - 7 g 3 nyckeltal följt av RF-mätning och MW extrapolering resultat i 3, 7, 10 och 20 ChAcNLS molekyler per 7 g 3. Av densitometry är procent monomer arten > 90% för 7 g 3 modifierad med 3-10 ChAcNLS. För 7G 3-ChAcNLS20 är sammanlagda arten 45%. Detta visar att SDS-PAGE är enkel men ändå effektiv för att välja en 7G 3-ChAcNLS-konjugat för vidareutveckling. Även om, liten smetar med antikropp kedjor kan uppstå på grund av antikropp glycosylation stör detta inte efter identifiering av aggregerade arter.
För procedur 2 visar representativa data skillnaderna mellan att använda trypsin och ingen trypsin när du utvärderar virus-derived peptid-modifierade ACs för intracellulära effektivitet ackumulering. I det här exemplet kan 7G 3-ChAcNLS förmåga att öka dess intracellulär ackumulation utvärderas i celler behandlas med och utan trypsin (figur 4). Dock framgår vikten av trypsinization vid tolkningen av ackumulering av konjugat som används för jämförelse för att bestämma AC effektivitet och selektivitet. Trypsinization möjliggör intracellulära fluorescens basnivå upprättas som observerats med omodifierade 7 g 3. Man kan i detalj att 7 g 3 begränsas till cytoplasman i små foci. Däremot celler som inte är trypsinized, 7G 3-specifika fluorescensen är begränsad till cellytan på grund av överuttryck av IL-3Rα på cellytan. Detta gör att det är svårt att undersöka intracellulär ackumulation och distribution eftersom fluorescensen på cellytan dominerar och därmed blockerar den intracellulära fluorescensen från att vara visualiseras. Trypsinizing celler är också viktigt när du utvärderar specificitet som bevis med IgG-ChAcNLS. Vi kan se att det är vissa icke-specifik fluorescens från cellytan men skulle inte kunna fastställa nivån på intracellulär ansamling orsakad av peptiden om cellerna inte var trypsinized. Slutligen, utan trypsinization kunde man falskeligen tolka att en nyutvecklad AC inte ackumuleras inuti målceller. Som sett med 7G 3-NLS, celler som inte är trypsinized majoriteten av fluorescens är igen från cellytan. Efter trypsinization, kan man observera att 7G 3-NLS ackumuleras, om än begränsad, släpper målceller.
För procedur 3 visar representativa data kvalitetskontroll för konstruktion, affinitet och in vitro- nyttolast leverans effektivitet och specificitet för radioisotoper 64Cu med A14-ChAcNLS. Densitometry utförs på röntgen bilder tagna från en 12% polyakrylamid gel innehållande 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, eller 64Cu-A14-ChAcNLS visar att de radiomärkt konjugat är 100% monomer arter (figur 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS visar nanomolar affinitet för IL-5Rα. A14-ChAcNLS som en funktion av ökande koncentrationer av 64Cu-A14-ChAcNLS avslöjade specifik bindning närmade sig mättnad i koncentrationer på 3-5 nM i både HT-1376 och HT-B9 celler (figur 5B). Kd för 64Cu-A14-ChAcNLS på HT-1376 och HT-B9 celler var 6,4 ± 1,7 nM respektive 3,1 ± 0,8 nM. ChAcNLS konjugation reducerad affinitet A14 cirka 2,5 gånger för IL-5Rα på HT-1376 och HT-B9 celler. Gamma inventering visar att ökningen av radioaktivitet i kärnan och cytoplasman levereras av 64Cu-A14-ChAcNLS är specifik och ökar över tiden (figur 6). Gamma räknar vanligtvis visar cirka > 6-fold ökning av kärn- och intracellulär ackumulation i celler behandlas med 64Cu-A14-ChAcNLS jämfört med behandling med 64Cu-A14-ChAcNLS i närvaro av överskott omodifierade A14 eller när behandlingsstudier utförs vid 4 ° C (figur 6A). Det finns också en ≥ 3-faldig ökning av kärnkraft och intracellulära ackumuleringen av 64Cu relativa till celler behandlas med 64Cu-A14 och 64Cu-IgG-ChAcNLS vid alla tidpunkter testas (figur 6B).
Figur 7 visar vikten av protokollet cell fraktionering. HT-1376 och HT-B9 celler inkuberades med plasmamembranet lyseringsbuffert innehållande 1%, 2% eller 4% NP-40. Isolerade kärnor bör uteslutande innehålla Lamin A/C. cytoplasmiska fraktioner bör därför vara exklusiva för Rab7. Som en kontroll, bör hela celler lyserat med RIPA bufferten vara positivt för Lamin A/C i båda fraktioner. Detta protokoll visar att när du utvärderar den nukleära fraktionen av lyserat HT-1376 celler, det finns ingen Rab7 närvarande. Dessutom finns det ingen Lamin A/C närvarande i cytoplasmiska fraktionen. Det finns dock en minskad mängd Rab7 i cytoplasman tas från celler lyserat med 4% NP-40 (figur 7A). Detta tyder sannolikt att 4% NP-40 lyseringsbuffert är störa det nukleära membranet förutom plasmamembranet. Detta resulterar i blandning av nukleära proteiner med cytoplasmatiska proteiner och därmed försvagar koncentrationen av Rab 7. Detta förklarar den minska mängden Rab 7 närvarande. HT-B9 celler är ännu känsligare än HT-1376 celler. När de behandlades med plasmamembranet lyseringsbuffert syns innehållande 4% NP-40, Lamin A/C tydligt i cytoplasmiska fraktionen (figur 7B). I området i närheten finns det en motsvarande nedsättning av Lamin A/C i kärn-fraktionen. HT-B9 celler är också känslig på 2% NP-40 lyseringsbuffert som Rab7 i cytoplasmiska fraktionen är synligt minskas i förhållande till 1% NP-40. Således bör en optimerar cellulär fraktionering med särskilda celler av intresse så att kvantitativa resultaten av nyttolast ackumulering i kärnan och intracellulära utrymmet är korrekta. Detta är viktigt för att utvärdera effektiviteten i cellkärnelokalisering av en roman AC.
För procedur 4 möjliggör PET imaging på 48 h efter injektion av antingen 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS eller 64Cu-A14-ChAcNLS i möss med HT-1376 och HT-B9 heterotopisk xenograft på motsatt bakben visualisering av tumör inriktning boenden (figur 8). Som i vårt exempel avslöjar visuell inspektion av PET-bilder HT-1376 och HT-B9 tumör målinriktning av 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 och 64Cu-A14-NLS (figur 8A). Men, i de fall okulärbesiktning är svårt som med HT-B9 tumörer, ROI-analys kan användas att bestämma tumör-till-muskel nyckeltal (figur 8B).
Figur 1: ChAcNLS-modifierade mAbs. NLS rester från SV-40 stora T-antigen (KKKRKV) inklämt mellan spacer restprodukter begränsas av en N-terminal cystein. Cholsyra (gröna fästet) är kopplat till cystein som tidigare beskrivits 34. Efter konstruktion och rening av ChAcNLS, cystein sulfhydryl gruppen används för konjugation via sulfo-SMCC (röda fästet; visas redan fäst vid en mAb). Obs: mAb (150 kDa) och ChAcNLS (1,8 kDa) är inte att skala. Anpassat och återges med tillstånd från Paquette, förbättrar M. et al. NLS-cholsyra syra konjugation för IL-5Rαspecific antikroppar cellulära ackumulering och invivo tumör-targeting boenden i urinblåsan cancer modell. Konjugationens kemi. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-
Figur 2: Schematisk av AC Cell behandlingsform och efterföljande behandling för analys av konfokalmikroskopi och för analys av Cell fraktionering kvaliteten. Röda pilarna motsvarar väsentliga steg 2.2, 2.3, 3.15 och 3.15.4. Anpassade och omtryckt med tillstånd från Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, en roman modifiering antikropp-konjugat tillåter Target-specifika Endosomal fly, lokalisering till Nucleus och förbättrad totala intracellulär ackumulation. Molekylär farmaci. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figur 3: analys av ChAcNLS-modifierade mAbs. En reducerande SDS-PAGE visar den löpande stegen (L) med motsvarande molekylvikter kilodalton (kDa) och omodifierad 7 g 3 tunga och lätta kedjor som referenser. De följande körfält är banden migration av tunga och lätta kedjor från 7 g 3 modifierad med 3, 7, 10 och 20 ChAcNLS.
Figur 4: analys av mAb intracellulär Distribution och ackumulering. Konfokalmikroskopi bilder som illustrerar den intracellulära 7 g 3 distribution och relativa fluorescens ackumulering i IL-3Rα-positiv leukemiceller behandlas med 7 g 3, 7 G 3-ChAcNLS, IgG och IgG-ChAcNLS. Cellerna var trypsinized eller inte trypsinized före fixering. Atomkärnor färgas med propidium jodid (PI, röd), anti-murine-Fc-AF647 dye (mAb; grön) och PI/mAb samman. Skalan är 50 μm. Inom trypsin och inga trypsin grupper förvärvades bilder med identiskt instrumentinställningar mellan olika ACs visas. Trypsin portion av figur 4 är anpassad från refefence 34 med tillstånd. Anpassade och återges med tillstånd från Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, en roman ändring antikropp-konjugat tillåter rikta-specifika Endosomal fly, lokalisering till Nucleus och förbättrad totala intracellulär ackumulation. Molekylär farmaci. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figur 5: 64Cu-A14-ChAcNLS renhet och affinitet. (A) 64Cu-märkt A14, A14-NLS, strålningskemisk renhet A14-ChAcNLS kontrollerades av SDS-PAGE följt av autoradiografi. (B) specifik bindning kurvor för 64Cu-A14 och 64Cu-A14-ChAcNLS på HT-1376 och HT-B9 celler. Felstaplar visar standardavvikelsen för experimentet utförs i replikera. Anpassat och återges med tillstånd från Paquette, M. et al. NLS-cholsyra syra konjugation för IL-5Rα-specifika antikroppar förbättrar cellulära ackumulering och invivo tumör-targeting boenden i urinblåsan cancer modell. Konjugationens kemi. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figur 6: 64Cu kärnkraft och intracellulär ackumulation. Representativa exempel på cell behandling utförs i tre exemplar (felstaplar beteckna standardavvikelse) att demonstrera (A) specificitet och (B) ackumulering förbättring av 64Cu-A14-ChAcNLS. % Ackumulering presenteras i kärnan (vänster paneler) och totala intracellulära utrymmet (rätt panelerna) i förhållande till den totala mängden radioaktivitet som används vid behandling av IL-5Rα-positiva invasive urinblåsan cancerceller. Felstaplar visar standardavvikelsen för experimentet utförs i replikera. * indikerar p ≤0.05.
Figur 7: analys av Cell fraktionering förfarande. Western blot av (A) kärn och (B) Cytoplasmic fraktioner för Lamin A/C (översta blotting, röda pilar) och Rab 7 (botten blotting; svarta pilar) erhålls från behandling av HT-1376 och HT-B9 celler i plasmamembranet lyseringsbuffert innehållande antingen 1%, 2% eller 4 % NP-40. Hela celler lyserat med RIPA buffert användes som positiv kontroll för Lamin A/C och Rab7 i båda fraktioner. Kör standarder (L) skildras endast i top blots. Tre pilar visas för Lamin A/C på grund av dess flera isoformer. Anpassade och omtryckt med tillåtelse från Paquette, M. et al. NLS-cholsyra syra konjugation för IL-5Rα-specifika antikroppar förbättrar cellulära ackumulering och invivo tumör-targeting boenden i urinblåsan cancer modell. Konjugationens kemi. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figur 8: In Vivo analys av tumören inriktning av PET Imaging och ROI-analys. (A) PET-bilder på 48 h efter injektion av nicka/SCID möss med HT-1376 (röda pilar) och HT-B9 (blå pilar) tumörer intravenöst injicerat med 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS och 64Cu-A14-ChAcNLS. Grön pil är leverns upptag. Muskel ROI ritning visas med magenta cirkel. (B) ROI HT-1376 och HT-B9 tumör-till-muskel förhållanden för ACs på 48 h efter injektion. Felstaplar visar standardavvikelsen för experiment i n = 10 ROIs per mus (n = 5). * indikerar p 0,05.
| Tat |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Cholsyra-CGYGPKKKRKVGG 34 |
Tabell 1: Lista över Tat och SV-40 stora T-antigen härrör peptider används i AC ändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stora målen systemisk leverans av anti-cancer är att öka ackumulering vid tumör webbplats och upptag inom cancerceller och minska oönskade biverkningar i friska vävnader. AC riktade leverans av molekylär nyttolaster till tumörceller är en mycket lovande metod att behandla och upptäcka tumörer. Men avsaknaden av effekt orsakas av endosome brottsprovokation och ner stream lysosomal nedbrytning förblir en viktig utmaning. Medan detta protokoll använder ChAcNLS peptiden som ett exempel för byggandet av nästa generation ACs, är beskrivna förfarandena anpassningsbar till alla peptid-modifierade AC utvecklas med målet att öka mängden av intracellulära levererade nyttolast för att riktade cancerceller.
De viktigaste stegen i detta protokoll är: 1) identifiera och begränsa hög MW aggregera arter. (2) trypsinization av celler före analys för att fastställa intracellulär ackumulation; (3) utför kvalitetssäkring av cellulära fraktionering förfaranden. och 4) utför PET imaging för att utvärdera tumör inriktning i vivo.
Det är viktigt konjugationen av virus-derived peptider till mAbs inte resulterar i hög MW sammanlagda arter som orsakas troligen av intramolekylära crosslinking mellan mAbs. Detta är den inledande oro och bör behandlas innan utvecklas ytterligare. Framåt med peptid-modifierade ACs som innehåller oönskade aggregat kan ge resultat som ger falska bevis på aspekter såsom intracellulära och i vivo nyttolast leverans profiler. Reaktiva maleimides på mAbs är vad är troligen ansvarig för kovalent aggregering. En lösning är att minska förhållandet sulfo-SMCC-till-mAb. Ett annat alternativ är att använda N-acetyl derivat av aminosyror såsom Cys, Lys, hans, Ser och Thr under peptid konjugation till den maleimide-aktiverat mAb 45. Nukleofil sida-kedjorna kan reagera med den maleimide delen av SMCC och minska intra-antikropp crosslinking. Separation av storlek utslagning kromatografi efter konjugering kan alternativt användas för att isolera monomer arter 45. Platsspecifika Konjugation av peptiden till antikroppen kan också utföras. Antikropp kolhydrater kan exempelvis ändras för konjugation till peptider, vilket har visat sig effektivt producera monomer arter 24.
SDS-PAGE med 12% polyakrylamidgeler är en billig och effektiv metod för att få ett brett perspektiv av stora skillnader i AC arter. Om en ökning av % polyakrylamid används, kommer att separation av tunga kedjor och intramolekylära arter vara svårt att skilja. Omvänt, om en reducerad % polyakrylamid används, de lätta kedjorna sannolikt springa bort gelen. Gradient geler som innehåller 4-20% polyakrylamid också ge bra kvarhållning skiftar för tunga och lätta kedjor på en enda gel. Bland de olika analytiska teknikerna tillgängliga för Biomolekylär analys är högpresterande vätskekromatografi och kapillär elektrofores-SDS överlägsna SDS-PAGE för separation och karakterisering av ACS- 46. SDS-PAGE är dock en tidig och billig metod att analysera den ursprungliga konstruktionen av dessa nya medel och sedan bestämma om den följande åtgärder.
Inkubering av celler i lösning innehållande 0,25% trypsin (steg 2,3), som tar bort ett maximalt antal cellytan proteiner och bundna ACs är viktigt eftersom det ger bättre visualisering och relativ ökning av intracellulära ackumuleringen mellan referens antikroppar. Kameran parametrar ställs att ta bilder med högsta fluorescensintensiteten. Detta är på grund av variationen från cell till cell mängden AC som ackumuleras. Således, fånga bilder på maximal intensitet gör att celler med mindre AC ackumulering kan också utvärderas. Cancer-antigener uttrycks dock vanligen mycket på tumörceller. Om cellerna inte utsattes för matsmältningen av trypsin, skulle sedan fluorescensen som härrör från ACs på cellytan-dominera bilden. Dessutom utan trypsinization kunde utveckling begränsas med ACs med subtila men betydande intracellulär ansamling egenskaper.
Att säkerställa hög kvalitet cellulära fraktionering är viktigt att noggrant utvärdera ansamling av 64Cu i kärnan kontra cytoplasman. ChAcNLS förmåga att öka AC och nyttolast intracellulär ackumulation beror på aktiva lokaliseringen till nucleus 34. Som framtida virus-peptider utvecklas, kan dessa peptider också lokalisera till kärnan som en del av deras mekanism för att öka effektiviteten i intracellulära nyttolast. Det är därför viktigt att cellulära fraktionering vara av hög kvalitet till exakt detalj denna process. Detta protokoll betonar vikten av att utvärdera atomkärnor cytoplasmiska markörer och också den cytoplasmiska fraktionen för nukleära markörer. Till exempel Hu et al., utvecklat en AC modifierad med en Tat peptid och utforskade nukleära ansamling av en radioisotop nyttolast 24. Western blot analys för calpain, en riklig cytoplasma protein, var närvarande i kärn-fraktionen. Detta var troligen eftersom kommersiella kärn isolering kit användes. Detta protokoll visat att HT-1376 och HT-B9 celler krävs olika koncentrationer av NP-40 för att isolera berikad atomkärnor med oskadade hinnor. När HT-B9 celler var lyserat med buffert var innehållande 4% NP-40, Lamin A/C närvarande i den cytoplasmiska bråkdel som anger behandling avbryts kärn membran och tillåtet för Lamin A/C ange cytoplasman. Om kärnkraft och cytoplasmiska fraktioner inte är isolerade noga, kan det vara svårt att identifiera bidrag cellkärnelokalisering till totala intracellulär ansamling. Det finns rapporter om biologiska - och artificiellt-härledda peptider som specifikt inriktar andra intracellulära fack såsom det endoplasmatiska nätverket, Golgiapparaten och mitokondrier 47,48,49. Alltså blir isoleringen av intracellulär fack alltmer relevant.
Detta protokoll avslutas med dess beskrivning av 64Cu-A14-ChAcNLS inriktning av HT-1376 och HT-B9 tumörer. Från den visuella inspektionen av PET-bilder i figur 8, det framgår av den ökade tumör PET signal i förhållande till den angränsande minskas omgivande bakgrunden 64Cu-A14-ChAcNLS har överlägsen inriktning av HT-1376 och HT-B9 tumörer (figur 8A ). ROI-analys visar också sin förmåga att utvärdera tumör inriktning. I vårt exempel använder vi ROI tumör-till-muskel nyckeltal att kvantifiera tumör inriktning och demonstrera 64Cu-A14-ChAcNLS är överlägsen AC (figur 8B). PET imaging möjliggör också utvärderingen av AC komplexbildare i friska organ. Levern är det primära organ som metaboliserar antikroppar. Figur 8A visar upptag i levern är jämförbar hos möss som injicerats med 64Cu-A14-ChAcNLS och 64Cu-A14. På denna tidiga utvecklingsfasen tyder denna data ChAcNLS inte orsakar oönskade komplexbildare. 64 Cu har en halveringstid på 12,7 h, som inte är idealisk för ACs som har halveringstider på flera dagar. Som tidigare beskrivits i visuella protokollet av Zeglis och Lewis används den långlivade radioisotop zirkonium-89 (89Zr) en nyttolast vars fysiska halveringstid är idealisk för mAbs och kan avbildas av PET 50. Således, för att utvärdera tumör leverans över flera dagar, 89Zr är ett förstahandsval. Detta är särskilt viktigt om terapi är ett mål där hög tumör upptag är gynnsam och ökar över tiden med antikroppar 7. Biodistribution bör också utföras för att fastställa enskilda organ upptag att ytterligare utforska inriktning eller binda egenskaperna för nyligen utvecklade ACs. Möss kan dessutom vara predosed med omodifierade specifika antikroppen att blockera receptorer på tumörcellerna att utvärdera inriktning specificitet. Dock ger 64Cu med PET imaging och ROI-analys tillräckligt en första bedömning av tumören leverans av utvecklade ACs presenteras i detta protokoll.
ACs modifierad med virus-derived peptider har hittills begränsats till leverans av radioisotoper. Detta är delvis på grund av historiska skäl och också eftersom radioisotoper enkelt kvantifieras under in vitro och i vivo tester och kan visualiseras med icke-invasiv avbildningsmetoder för hela kroppen. Naturligt, eftersom fältet expanderar till transport och leverans av payloads än radioisotoper, såsom kemoterapeutika, enzymer och oligonukleotider, ändringar av metoder som beskrivs i detta protokoll kommer att behöva utvecklas. Exempelvis kommer att nya metoder för utvärdering av intracellulära ackumuleringen av alternativa nyttolaster behöva utvecklas. Dessutom kommer ändringar i vivo utvärdering bee nödvändigt eftersom dessa nyttolaster inte kan avbildas enkelt och därför blir det svårt att bedöma biodistribution, specificitet och tumör upptag effektivitet. Av dessa skäl bör radionuklid nyttolaster förbli som surrogat nyttolaster för framtida utveckling med alternativa laster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av den Cancer Research Society (Kanada) och CIMS. Författarna tackar Dr. Samia Ait-Willy och Jean-Francois Beaudoin för hjälp. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) för mAb A14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
- Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
- Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
- Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
- Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
- Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
- Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
- Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
- Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
- Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
- Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
- Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
- Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
- Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
- Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
- Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
- Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
- Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
- Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
- Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
- Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
- Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
- Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
- Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
- Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
- Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
- Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
- Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
- Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
- Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
- Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
- Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
- Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
- Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
- Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
- Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
- Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
- Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
- Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
- Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
