Summary

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Published: March 22, 2017
doi:

Summary

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Abstract

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduction

Kalp embriyo 1, 2 geliştirmek için ilk fonksiyonel bir organdır. dolaşım sistemi ile birlikte, bu oksijen, besin ve geliştirme sırasında bir atık bertaraf mekanizması sağlamaktadır. Üç hafta döllenmeden sonra, insan kalbi ilk kez yener ve onun uygun düzenleme kardiyomiyositlerde (CMS) tarafından yapılmaktadır. Bu özel hücrelerin geri dönüşümsüz kaybı dolayısıyla ilerici kalp yetmezliği altında yatan temel bir konudur. Böyle Zebra balığı ve Xenopus gibi bazı organizmaların kalp rejenerasyon potansiyeli varken, yetişkin memeli kalp 3, 5, 6 daha sınırlıdır. Böylece, kalbin kritik işlevi göz önüne alındığında, kalp hastalığı tek başına 7 Amerika Birleşik Devletleri'nde 600.000 ölüm için muhasebe, dünyada önde gelen ölüm nedeni olduğunu şaşırtıcı değildir.verimli tamir veya yaralı miyokard yerine refore, hücre bazlı terapiler büyük bir klinik öneme sahiptir.

Yamanaka ve arkadaşları 8 seminal Çalışma dört transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade pluripotent kök hücreleri tamamen farklılaşmış fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tüm pluripotent kök hücre stratejilerinin tümörijenik kapasitesi terapötik amaçlar için kullanımı ile önemli bir sorun olmuştur. Bu bir pluripotent sahne kaçınarak alternatif yöntemler hücrelerin transdifferentiate için aramak için bilimsel alanını motive etti. Son zamanlarda, çeşitli gruplar transkripsiyon ektopik ifadesi ile uyarılan kardiyomiyosit-benzeri hücreler (iCLMs) fare fibroblast doğrudan dönüşüm göstererek bu stratejinin uygulanabilirliğini göstermiştir Gata4, Mef2c Tbx5 ve daha sonra, Hand2 (GMT ve GHMT faktörleri sırasıyla) 9, 10. furthermore aynı strateji, in vivo olarak, insan-türevi doku 9, 11, 12 gerçekleştirilebilir. Son çalışmalar, ek faktörler ya da daha fazla kalp yeniden programlama verim 13, 14, 15 geliştirmek için modüle edilebilir yolakları sermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar rejeneratif tedaviler için yönlendirilmiş transdiferansiyonun potansiyelini göstermektedir. Ancak, metodolojik farklılıklara 16 CM yeniden programlama, bilinmeyen moleküler mekanizmaları, tutarsız tekrarlanabilirlik düşük verimlilik ve iCLMs heterojen yapısı adressiz kalır.

şirketinden iCLM heterojen değerlendirmek için biz sarkomer gelişimi ve kardiyak nesilli Specificatio tanımlanması için ayrı ve sağlam tek hücreli deneyi tasarlanmıştırN-iki fonksiyonel kardiyomiyositlerde gerekli özellikleri. Atriyal (AM), ventriküler (VM) ve kalp pili (PM) 17, 18, 19, 20: konumlarını ve eşsiz elektriksel özellikleri ile tanımlanan kalbinde CM en az üç ana tipi vardır. Bir orkestra birlikte, onlar kan düzgün pompalama sağlar. Kalp yaralanması sırasında, bir veya tüm alt tipleri etkilenebilir ve hücre tedavisi tip bir vaka ile ayrı ayrı ele alınması gerekir. az iş alt tipi özellikleri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için yapılırken Şu anda, en stratejileri, kardiyomiyositlerinin genel nesil odaklanmak.

Aşağıdaki çalışma düzgün iyi organize sarkomer ölçmek kardiyomyosit alt tiplerinin çeşitli bir dizi tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Kalp pili (PM) 'e özgü muhabir Fareyi kullanarak, biz bir i uygulamak mümkünmmunocytochemical yaklaşım kaynaklı atriyal benzeri miyositleri (IAM), uyarılmış ventriküler benzeri miyositleri (IVM) ve uyarılmış PM benzeri miyositleri (IPMS) 21 ayırt etmek. Bizim gözlemlere dayanarak sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan dayak yeteneğine sahiptirler. Bu eşsiz yeniden programlama platformu rolünü değerlendirmek için izin verir tek hücreli çözünürlükte sarkomer organizasyonu, alt tip şartname ve CM yeniden programlama verimliliği belli parametreleri.

Protocol

Hayvan uygulamaları içeren tüm deneysel prosedürleri UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Hcn4-GFP E12.5 Fare Embriyonik Fibroplastı 1. izolasyonu (MEFS) homozigot Hcn4-GFP erkeklerde ve CD-1 dişiler arasındaki zamanlanmış çiftleşmelerin ayarlayın. karbondioksit ötanazi ve sonraki servikal dislokasyon ile E12.5 hamile kadın Kurban. , Daha önce 23 <sup cl…

Representative Results

PM-spesifik raportör fare yararlanan biz Şekil 1'de gösterildiği gibi çeşitli endojen miyositleri tanımlamak için multipleks immün strateji geliştirdi. Şekil 2'de gösterilen yeniden programlama adımları aşağıdakı, alt özel CMS indüksiyonu olsa düşük bir oranda, erken 4. günde 21 olarak tespit edilebilir. 14. günde tarafından, deney durdurulabilir ve sarkomer organizasyonu (Şekil 3)</stron…

Discussion

Bu çalışmada kardiyak transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade yoluyla kardiyak alt tiplerinin farklı setine MEFS dönüşüm için doğrudan yeniden programlama strateji sağlar Gata4, Mef2c Tbx5 ve Hand2 (GHMT) faktörleri. Bir PM özgü muhabiri fare ile birlikte bir multipleks immün yaklaşımı kullanarak, biz tek bir hücre çözünürlükte IAM, IVMS ve IPMS tespit edebiliyoruz. Böyle bir tahlil alt tip çeşitlilik ve sarkomer geliştirilmesine yönelik bireysel transkripsiyon faktörlerinin katkıları …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Materials

DMEM Sigma D5796 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059 Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS) Sigma F2442 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher Scientific 41400-045 Component of iCLM media
MEM vitamin solution Thermo Fisher Scientific 11120-052 Component of iCLM media
MEM amino acids Thermo Fisher Scientific 1601149 Component of iCLM media
Non-Essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050 Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics Thermo Fisher Scientific 15240062 Component of iCLM media
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum Thermo Fisher Scientific 26050-088 Component of iCLM media
NaPyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-70 Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 1514022 Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin  Thermo Fisher Scientific A11139-03 Component of Plat-E media
Blasticidin   Gemini Bio-Products 400-128P Component of Plat-E media
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700 Zeiss For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent Promega E2692 Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985-070 Transfection reagent 
Polybrene Millipore TR-1003-G Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic CellBiolabs RV-101 Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA Thermo Fisher Scientific For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) Sigma A7811 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY Thermo Fisher Scientific A10262 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA  Abgent AP8534A Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG  ProteinTech 10906-1-AP Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Vector Labs H-1500 Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides Thermo Fisher Scientific 12-550-15 25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12mm coverslips NeuVitro Corp GG-12-1.5 Coverslips for confocal analysis
100um cell strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-19
0.45um Syringes filters SFCA 25MM Thermo Fisher Scientific 09-740-106 For virus filtration
6ml Syringes Covidien 8881516937 For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 Abcam AB150169 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)  Thermo Fisher Scientific A31573 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 Thermo Fisher Scientific A21422 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100 Sigma 93443-100ml For cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) Sigma D8537
Power Block 10X Universal Blocking reagent Thermo Fisher Scientific NC9495720 Dilute to 1X in H20
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) Electro Microscopy Sciences  15710 Use at 4% diluted in dH20
6 cm  plates Olympus 25-260
6-well plates Genesee Scientific 25-105
24-well plates Genesee Scientific 25-107
10 cm Tissue culture dishes Corning 4239
15 cm  Tissue culture dishes Thermo Fisher Scientific 5442
15 ml Conical tubes Corning 4308
50 ml Conical tubes Corning 4249
0.4% Trypan blue solution Sigma T8154 For viability
Ethyl Alcohol 200 proof Thermo Fisher Scientific 7005
Bleach Thermo Fisher Scientific 6009

References

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Play Video

Cite This Article
Fernandez-Perez, A., Munshi, N. V. Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts. J. Vis. Exp. (121), e55456, doi:10.3791/55456 (2017).

View Video