Summary

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

Published: March 22, 2017
doi:

Summary

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Abstract

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduction

心臓は胚1、2に開発した最初の機能的器官です。循環器系に関連して、開発中に、酸素、栄養素、および廃棄物処理機構に供給する。三週間受精後、人間の心は初めて打つとその適切な規制は、心筋細胞(のCM)によって維持されています。これらの特殊化した細胞の不可逆的損失は、したがって、進行性の心不全の根底にある基本的な問題です。このようなゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのようないくつかの生物は、心臓の再生の可能性を有しているが、大人の哺乳類の心臓は3、5、6、より限定されています。このように、心の重要な機能を考えると、心臓病は米国だけで60万人が死亡7を占め、世界における死亡の主な原因であることは驚くべきではありません。ザrefore、効率的に負傷した心筋を修理または交換するために、細胞ベースの治療は臨床上非常に興味深いものです。

山中ら8の精液の研究は、4つの転写因子の強制発現は、多能性幹細胞に完全に分化した線維芽細胞に変換するのに十分であることを示しました。しかし、すべての多能性幹細胞戦略の腫瘍形成能力は、治療目的のためのそれらの使用における重大な関心事となっています。これは、多能性段階を回避しながら細胞を分化転換するための代替方法を検索するための科学的なフィールドをやる気。最近、いくつかのグループは、転写の異所性発現は、GATA4、MEF2C、TBX5、および後に、Hand2(GMTとGHMT因子を用いて誘導心筋細胞様細胞(iCLMs)にマウス線維芽細胞の直接変換を表示することにより、この戦略の実現可能性を示していますそれぞれ)9,10。 Furthermore、同じ戦略は、 インビボおよびヒト由来の組織9、11、12で行うことができます。最近の研究では、追加の因子またはさらなる心臓再プログラミング効率13、14、15改善するために調節することができるシグナル伝達経路を強調しています。まとめると、これらの研究は、再生治療のために向かう分化転換の可能性を示します。しかし、方法論的差異16にCMの再プログラミング、未知の分子機構、一貫性のない再現性の低効率、およびiCLMsの不均一な性質は、アドレス指定されないままです。

直接iCLM不均一性を評価するために、我々は、サルコメアの開発および心臓系統specificatioの同定のために離散的で堅牢な単一細胞アッセイを設計しましたn-2の機能的心筋細胞の必要な特性。それらの場所でユニークな電気的特性によって定義されたCMの少なくとも三つの主要なタイプは、心臓である:心房(AM)は、心室(VM)及びペースメーカー(PM)17、18、19、20。オーケストレーションの組み合わせで、それらは、血液の適切なポンピングを可能にします。心臓損傷の間、一つまたはすべてのサブタイプが影響を受ける可能性があり、および細胞治療のタイプは、ケースバイケースで対処する必要があります。少し作業は、サブタイプの仕様を調節する分子メカニズムを研究するために行われている間、現在、ほとんどの戦略は、心筋細胞の全体的な世代に焦点を当てています。

以下の研究は、適切によく組織サルコメアを定量化し、心筋細胞のサブタイプの多様なセットを識別する方法について詳しく説明します。ペースメーカー(PM)特異的レポーターマウスを用いて、Iを適用することができます誘導された心房のような筋細胞(IAM)、誘導された心室のような筋細胞(IVM)、および誘導されたPM-様筋細胞(IPMS)21を区別するためにmmunocytochemicalアプローチ。我々の観察に基づいて、サルコメア組織を示す細胞のみが自発的な拍動することが可能です。このユニークな再プログラミングプラットフォームは役割を評価することができます サルコメア組織、サブタイプの仕様、および単一セルの解像度でCMの再プログラミングの効率の特定のパラメータの。

Protocol

動物プラクティスを含む全ての実験手順は、UTサウスウェスタン医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 HCN4-GFP E12.5マウス胚線維芽細胞(MEFの)の1の単離ホモ接合HCN4-GFPの雄とCD-1雌との間の時限交配を設定します。 二酸化炭素安楽死とその後の頸椎脱臼によりE12.5で妊娠中の女性を生け贄に捧げます。 2+、</s…

Representative Results

PM固有のレポーターマウスを利用して、我々は、 図1に示されるように、多様な内因性の筋細胞を同定するための多重免疫戦略を開発しました。 図2に示す書き換え手順に続いて、サブタイプ特異的のCMの誘導は、低レートではあるが、早ければ4日目21として検出することができます。 14日目では、実験は、サルコメア組織(…

Discussion

本研究は、心臓転写のレトロウイルス媒介発現を介して、心臓のサブタイプの多様なセットにしたMEFの変換のためのダイレクトリプログラミング戦略を提供することはGATA4、MEF2C、TBX5、およびHand2(GHMT)要因。 PM固有レポーターマウスと組み合わせて多重免疫染色法を用いて、我々は、単一細胞の解像度でIAM、IVMS、およびIPMSを識別することができます。このようなアッセイは、サブタイプの…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Materials

DMEM Sigma D5796 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059 Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS) Sigma F2442 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher Scientific 41400-045 Component of iCLM media
MEM vitamin solution Thermo Fisher Scientific 11120-052 Component of iCLM media
MEM amino acids Thermo Fisher Scientific 1601149 Component of iCLM media
Non-Essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050 Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics Thermo Fisher Scientific 15240062 Component of iCLM media
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum Thermo Fisher Scientific 26050-088 Component of iCLM media
NaPyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-70 Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 1514022 Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin  Thermo Fisher Scientific A11139-03 Component of Plat-E media
Blasticidin   Gemini Bio-Products 400-128P Component of Plat-E media
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700 Zeiss For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent Promega E2692 Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985-070 Transfection reagent 
Polybrene Millipore TR-1003-G Induction reagent. Use at a final concentration of 8um/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic CellBiolabs RV-101 Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA Thermo Fisher Scientific For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) Sigma A7811 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY Thermo Fisher Scientific A10262 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA  Abgent AP8534A Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG  ProteinTech 10906-1-AP Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Vector Labs H-1500 Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides Thermo Fisher Scientific 12-550-15 25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12mm coverslips NeuVitro Corp GG-12-1.5 Coverslips for confocal analysis
100um cell strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-19
0.45um Syringes filters SFCA 25MM Thermo Fisher Scientific 09-740-106 For virus filtration
6ml Syringes Covidien 8881516937 For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 Abcam AB150169 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)  Thermo Fisher Scientific A31573 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 Thermo Fisher Scientific A21422 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100 Sigma 93443-100ml For cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) Sigma D8537
Power Block 10X Universal Blocking reagent Thermo Fisher Scientific NC9495720 Dilute to 1X in H20
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) Electro Microscopy Sciences  15710 Use at 4% diluted in dH20
6 cm  plates Olympus 25-260
6-well plates Genesee Scientific 25-105
24-well plates Genesee Scientific 25-107
10 cm Tissue culture dishes Corning 4239
15 cm  Tissue culture dishes Thermo Fisher Scientific 5442
15 ml Conical tubes Corning 4308
50 ml Conical tubes Corning 4249
0.4% Trypan blue solution Sigma T8154 For viability
Ethyl Alcohol 200 proof Thermo Fisher Scientific 7005
Bleach Thermo Fisher Scientific 6009

References

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Play Video

Cite This Article
Fernandez-Perez, A., Munshi, N. V. Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts. J. Vis. Exp. (121), e55456, doi:10.3791/55456 (2017).

View Video