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의학

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

Published: July 03, 2017
doi:
10.3791/55495
, , , , ,
1National Healthcare Group Eye Institute,Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI),Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering,Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems,National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program,DUKE-NUS Graduate Medical School

Summary

Die Live-Zell-Bildgebung der markierten Blutzellen im Augenkreis kann Informationen über Entzündungen und Ischämie bei diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration liefern. Ein Protokoll zur Etikettierung von Blutzellen und Bild der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation ist beschrieben.

Abstract

Die retinale und choroidale Blutflussdynamik kann einen Einblick in die Pathophysiologie und Folgeerscheinungen verschiedener Augenkrankheiten wie Glaukom, diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und andere okuläre Entzündungszustände geben. Es kann auch helfen, die therapeutischen Reaktionen im Auge zu überwachen. Die korrekte Markierung der Blutzellen, gepaart mit der lebenden Zellenabbildung der markierten Zellen, ermöglicht die Untersuchung der Strömungsdynamik im Netzhaut- und Aderhautkreislauf. Hier beschreiben wir die standardisierten Protokolle von 1,5% Indocyaningrün (ICG) und 1% Natriumfluorescein-Markierung von Mäusen-Erythrozyten bzw. Leukozyten. Die Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) wurde angewendet, um die markierten Zellen in der Retinalzirkulation von C57BL / 6J-Mäusen (Wildtyp) zu visualisieren. Beide Methoden zeigten deutliche fluoreszenzmarkierte Zellen in der Maus-Retinalzirkulation. Diese Etikettierungsmethoden können breitere Anwendungen bei verschiedenen Augenerkrankungen habenModelle.

Introduction

Das Studium der Strömungsdynamik der Blutzellen im Netzhaut- und Aderhautkreislauf ist für das Verständnis der Pathogenese potenziell visionsbedrohender Augenkrankheiten und anderer okulärer entzündlicher Zustände unerlässlich. Die herkömmlichen Angiographietechniken, die die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen an Plasmaproteine ​​beinhalten, liefern jedoch keine Information über die Dynamik der Erythrozyten oder Leukozyten 1 . Die Erythrozyten-Retinalströmungsdynamik ist wichtig für das Studium der metabolisch wirksamen Zirkulation in der Netzhaut und die Leukozytenströmungsdynamik zum Verständnis der Zellmigration, der Erkennung, der Adhäsion und der Zerstörung bei verschiedenen entzündlichen Zuständen. Es gibt mehrere fluoreszierende Moleküle, die bei der Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Zelltypen verwendet werden 3 . Die Hämodynamik der Blutzellen kann durch Färbung mit den entsprechenden Fluoren gemessen werdenCent-Farbstoffe und Anwendung der richtigen bildgebenden Techniken 4 .

Die Anwesenheit von entzündlichen Reaktionen bei intraokularen Erkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und diabetische Retinopathie (DR) beinhaltet die Akkumulation von Lymphozyten im kranken Bereich 5 , 6 . Die Verfolgung der Immunzellen in den Geweben kann dazu beitragen, die komplexen Ereignisse in den Mechanismus der Krankheit Pathogenese beteiligt zu verstehen. Radioaktive Isotope wie 51 Cr und 125 wurden als Zelltracer in frühen Studien verwendet. Diese Farbstoffe sind giftig und beeinflussen die Lebensfähigkeit der Zellen. Obwohl die radioaktiven Marker 3H und 14C aufgrund ihrer geringeren Emissionsenergien weniger toxisch für die Zellen sind, ist es schwierig, ihre Signale im System 7 , 8 zu detektieren. Eine Anzahl von Fluorochrom-Farbstoffen wurden eingeführt, um die potentiellen Probleme zu überwindenIth radioaktive Marker und Track-Lymphozyten-Migration in vitro mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 und Thiazolorange sind DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Verfolgung von Lymphozyten in vivo verwendet werden. Hoechst 33342 bindet an AT-reiche Regionen in der DNA, ist membranpermeabel, behält Fluoreszenzsignale für 2 – 4 Tage und ist resistent gegen Abschrecken 9 , 10 . Die Nachteile von Hoechst 33342 und Thiazolorange sind die Hemmung der Lymphozytenproliferation 11 und die kurze Halbwertszeit bzw. 9 .

Calcein-AM, Fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-Bis- (2-carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein, Acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (und-6) Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) und 5- (und-6) -Carboxyfluoresceindiacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)Sind die zytoplasmatischen Fluoreszenzfarbstoffe, die für Lymphozytenmigrationsstudien verwendet werden. Allerdings haben FDA, CFDA und CFDA-AM eine niedrigere Retention in den Zellen 9 . BCECF-AM reduziert die proliferative Reaktion und beeinflusst die Chemotaxis- und Superoxidproduktion 9 , 12 . Calcein-AM ist ein fluoreszierender Farbstoff und nützlich für kurzfristige in vivo- Lymphozyten-Migrationsstudien. Es strahlt starke Fluoreszenzsignale aus, stört nicht die meisten zellulären Funktionen und behält fluoreszierende Signale für bis zu 3 Tage 12 , 13 bei . Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE) sind kovalente Kopplungs-Fluoreszenzfarbstoffe, die für Lymphozytenmigrationsstudien verwendet werden. FITC zeigt keine Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit und hat eine stärkere Affinität zu B-Lymphozyten als die T-Lymphozyten 14 , 15 </suP>. Die CFDA-SE-markierten Lymphozyten können in vivo für mehr als 8 Wochen und bis zu 8 Zellteilungen 9 , 16 verfolgt werden . C18 DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 und PKH26 sind Membran- Einfügen von fluoreszierenden lipophilen Carbocyaninfarbstoffen, die zur Markierung von Leukozyten und Erythrozyten verwendet werden. C18 Dil und DiO zeigen höhere Signale, wenn sie in die Zellmembran eingebaut werden und sind relativ ungiftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- und PKH26-markierte Zellen zeigen eine gute Retention der Fluoreszenzsignale mit weniger Toxizität 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Allerdings reguliert PKH2 down die CD62L-Expression und reduziert die ly Mphozytenlebensfähigkeit 23 .

Die meisten der oben erwähnten Studien wurden durchgeführt, um die Lymphozytenmigration und -proliferation in den Lymphgefäßen zu verfolgen und die markierten Erythrozyten in der nicht-okulären Zirkulation zu untersuchen. Es gibt sehr wenige Studien, die die Etikettierungstechniken anwenden, um die Blutzellen in der Augenzirkulation zu untersuchen. Die Anwendung der Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) hat einen großen Vorteil beim Studium der markierten Zellen in der Netzhaut- und Aderhautzirkulation in vivo durch Fundusangiographie 24 . Es gibt mehrere Fluoreszenzfarbstoffe wie ICG, Acridinorange, FITC, Natriumfluorescein und CFDA, die verwendet werden, um die Leukozyten in der Retinalzirkulation durch SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Die Phototoxizität und Karzinogenität von Acridinorange 26 , 27 , die Interferenz von FITC mit der zellulären Aktivität und die Anforderung eines intravaskulären Kontrastmittels für die Auflösung der retinalen und choroidalen Blutgefäße beschränken ihre Anwendung in in vivo Tierversuchen 29 . Natriumfluorescein und ICG sind ungiftig, von der Food and Drug Administration genehmigt und sicher für die Prüfung auf Menschen 32 , 35 . Die meisten der dynamischen Strömungsstudien beziehen sich auf die Markierung der Leukozyten oder Erythrozyten und deren Visualisierung in den Netzhaut- und Aderhautblutgefäßen 36 , 37 , 38 , 39 </sUp>. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll der ICG-Markierung der Erythrozyten, die Natriumfluorescein-Markierung der Leukozyten und die Verfolgung der sichtbaren markierten Zellen in der Maus-Retinalzirkulation unter Verwendung von SLO.

Protocol

Die Tierprotokolle, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von SingHealth, Singapur, genehmigt und entsprechen den Richtlinien der Vereinigung für Forschung in der Vision und Ophthalmologie (ARVO) Erklärung zur Verwendung von Tieren in Ophthalmologie und Vision Forschung. 1. Markierung von Erythrozyten und Leukozyten mit Fluoreszenzfarbstoffen Vorbereitung der Reagenzien Bereiten Sie ICG (1,5 mg / ml) vor, indem Sie 3 m…

Representative Results

Erythrozyten, markiert mit 1,5% ICG, wurden in der Netzhautzirkulation von C57BL / 6J-Mäusen (Wildtyp) sichtbar gemacht. Sowohl 1% als auch 5% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten waren im Retinalkreislauf zu unterscheiden. Allerdings wurden die einzelnen markierten Zellen mit 1% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten deutlicher sichtbar gemacht ( Abbildung 1 ). In 5% Hämatokrit war es aufgrund der großen Anzahl markierter Zellen in …

Discussion

Das Studium der Hämodynamik im Netzhaut- und Aderhautkreislauf ist für das Verständnis der Pathophysiologie vieler Augenerkrankungen unerlässlich. Die Blutflussdynamik in der Netzhautzirkulation kann durch Fourier-Domänen-optische Kohärenztomographie (FD-OCT), Laser-Speckle-Flowgraphie (LSFG) und Netzhautoximetrie untersucht werden. Obwohl diese Methoden unterschiedliche Ansätze zur Untersuchung des Gesamtblutflusses in der Netzhautzirkulation 40 , 41 <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das Forschungsprojekt wurde unter dem New Investigator-Stipendium des National Medical Research Council (NMRC), Singapur, finanziert. Das Team wird gern die von Dr. Agrawal am Institut für Ophthalmologie (IoO), University College London (UCL) unter National Medical Research Council (NMRC) ausländische Forschungsausbildungsstipendien von November 2012 bis Oktober 2014 unter Mentoren von Prof. David Shima Dr. Agrawal erwarb das Konzept und die Fähigkeiten für die Etikettierung der Zellen und die Live-Bildgebung in Dr. Shimas Labor. Das Team wird daher während der Trainingsstiftung von Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh und Dr. Daiju Iwata, die Betreuung und Führung anerkennen.

Materials

Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1
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References

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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).
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