Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, les canal-rhodopsines sont devenues indispensables dans la recherche neuro-scientifique où elles sont utilisées comme outils pour manipuler des processus électriques de manière non invasive dans des cellules cibles. Dans ce contexte, la sélectivité ionique d'une canalrhodopsine revêt une importance particulière. Cet article décrit l'étude de la sélectivité des chlorures pour une canalisation de chrysomies de Proteomonas sulcata, récemment identifiée, par des enregistrements électrophysiologiques sur les cellules HEK293. La procédure expérimentale pour la mesure des photocourteurs à lumière modérée nécessite une source de lumière rapide commutable – idéalement monochromatique – couplée au microscope d'une configuration pare-brise conventionnelle. Les procédures préparatoires avant l'expérience sont décrites impliquant la préparation de solutions tamponnées, des considérations sur les potentiels de jonction liquide, l'ensemencement et la transfection des cellules, et le tirage des pipettes patch. L'enregistrement réel de la relation courant-tensionS pour déterminer les potentiels d'inversion pour différentes concentrations de chlorure se déroule de 24 h à 48 h après la transfection. Enfin, les données électrophysiologiques sont analysées en fonction des considérations théoriques de la conduction du chlorure.
Introduction
Les canarhodopsines (ChR) sont des canaux ioniques à lumière qui se produisent dans l'oeil des algues vertes mobiles et servent de photosensors primaires pour la phototaxie et les réponses phobies 1 . Depuis leur première description en 2002 2 , les ChR ont ouvert la voie au domaine émergent de l'optogenèse et peuvent être appliqués dans une variété de cellules excitables, par exemple dans les muscles squelettiques, le cœur ou le cerveau 3 , 4 , 5 . L'expression des ChR dans les cellules cibles entraîne une perméabilité aux ions pouvant être contrôlée par la lumière de la cellule respective. Dans un contexte neuronal, cela permet l'activation 6 , 7 , 8 ou l'inhibition 9 , 10 du déclenchement du potentiel d'action (AP) – en fonction de l'ion conduit – avec l'espace et le tempsPrécision de la lumière en soulignant comment la sélectivité ionique d'un variant de ChR détermine son application optogénétique.
Les premiers ChR découverts de Chlamydomonas reinhardtii et Volvox carteri sont perméables aux protons, mais aussi aux cations monovalents comme le sodium, le potassium et, dans une moindre mesure, les cations divalents tels que le calcium et le magnésium 11 , 12 , 13 . Aujourd'hui, plus de 70 channelrhodopsins (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 et plusieurs variantes conçues 18 , 19 , 20 avec des propriétés différentes telles que La taille du photocourant, la sensibilité spectrale, la cinétique et la sélectivité des cations sont disponibles. Alors qu'en neuroscience, les CCR sontSont utilisés pour activer les cellules et déclencher des AP, les pompes microbiennes à lumière ont été les seuls antagonistes disponibles pour faire diminuer les neurones pendant des années. En 2014, deux groupes ont simultanément montré que les CCR peuvent être transformés en canal-triopsines conductrices d'anions (ACR) par altération de la polarité le long du pore porteur d'ions putatif via l'ingénierie moléculaire 9 , 21 . Par la suite, des ACR naturels ont été identifiés dans plusieurs algues cryptophytes 22 , 23 , 24 . Plus important encore, l'activation légère des ACR médiatise les courants de chlorure dans les neurones adultes, ce qui permet d'inhiber l'activité neuronale à des intensités lumineuses beaucoup plus faibles que les pompes microbiennes qui ne transportent que des charges individuelles par photon absorbé.
L'activité ChR peut être directement traitée par des enregistrements électrophysiologiques de pinces de courants induits par la lumière dans des cellules HEK293. Le patch-clampLa technique a d'abord été développée à la fin des années 1970 25 et améliorée par Hamill et al. , Permettant l'enregistrement de l'entité des courants à partir d'une petite cellule (mode cellule entière) avec une résolution de courant élevée et une commande directe de la tension de la membrane 26 . Appliquée dans la culture cellulaire, cette technique assure un contrôle précis des conditions d'enregistrement ioniques et électriques et permet d'étudier la sélectivité ionique ainsi que la contribution relative des ions au courant total. Ici, nous illustrons l'examen de la sélectivité ionique pour la canalodromycine conductrice d'anion de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via l'enregistrement des relations tension-tension sous différentes concentrations de chlorure extracellulaire pour prouver une forte conductance du chlorure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La détermination des potentiels de renversement dans des conditions ioniques et électriques définies fournit des informations sur les espèces d'ions transportées après activation légère de ChRs. Si exclusivement, une espèce d'ions varie dans un milieu physiologique complexe et les changements de potentiel d'inversion obtenus selon le potentiel théorique de Nernst, cette espèce ionique est la seule transportée.
Cependant, pour les ChR, les changements de potentiel d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Maila Reh, Tharsana Tharmalingam et surtout Altina Klein pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche allemande (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 à PH) et le Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) et E4 (PH).
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
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