كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
على مدى العقد الماضي، أصبح تشانلرودوبسينز لا غنى عنه في البحوث علم الأعصاب حيث أنها تستخدم كأدوات للتلاعب غير الغازية العمليات الكهربائية في الخلايا المستهدفة. في هذا السياق، الانتقائية أيون من تشانلرودوبسين هي ذات أهمية خاصة. توضح هذه المقالة التحقيق في انتقائية الكلوريد ل أنيون-كونفيغنينغ تشانلرودوبسين من بروتيموناس سولكاتا عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك على خلايا HEK293. الإجراء التجريبي لقياس فوتوكرنتس بوابات الخفيفة يتطلب سريع للتحويل – أحادية اللون مثالي – مصدر الضوء إلى جانب المجهر من الإعداد على خلاف ذلك التصحيح المشبك التقليدي. يتم توضيح الإجراءات التحضيرية قبل التجربة التي تنطوي على إعداد حلول مخزنة، والاعتبارات على إمكانيات تقاطع السائل، والبذر وترنسفكأيشن من الخلايا، وسحب ماصات التصحيح. التسجيل الفعلي للعلاقة الجهد الحاليثانية لتحديد إمكانات انعكاس لمختلف تركيزات الكلوريد يأخذ مكان 24 ساعة إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وأخيرا، يتم تحليل البيانات الكهربية فيما يتعلق الاعتبارات النظرية من توصيل الكلوريد.
Introduction
تشانلرودوبسينز (شر) هي قنوات ايون ضوء بوابات التي تحدث في بقعة العين من الطحالب الخضراء المتحركة، وتكون بمثابة أجهزة الاستشعار الضوئية الأولية للالاستشعار والردود الرهابية 1 . منذ وصفها الأول في عام 2002 2 ، شرس مهدت الطريق لمجال الناشئة من علم الوراثة الضوئية ويمكن تطبيقها في مجموعة متنوعة من الخلايا المنفعلة على سبيل المثال داخل العضلات والهيكل العظمي، والقلب، أو الدماغ 3 ، 4 ، 5 . التعبير عن شرس في الخلايا المستهدفة النتائج في نفاذية أيون الضوء يمكن السيطرة عليها من الخلية المعنية. في سياق الخلايا العصبية، وهذا يسمح تفعيل 6 ، 7 ، 8 أو تثبيط 9 ، 10 من العمل المحتملة (أب) إطلاق – اعتمادا على أيون أجريت – مع المكانية والزمانيةدقة الضوء التي تؤكد كيفية انتقائية أيون من البديل شر يحدد تطبيق أوبتوجينيتيك لها.
وقد اكتشفت أول شرس من كلاميدوموناس راينهاردتي وفولفوكس كارتيري نفاذية للبروتونات، ولكن أيضا إلى الكاتيونات أحادي التكافؤ مثل الصوديوم والبوتاسيوم، وبدرجة أقل إلى الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم والمغنيسيوم 11 ، 12 ، 13 . اليوم، أكثر من 70 الموجبة الطبيعية الموجبة تشانلرودودبسينز (سرس) 14 و 15 و 16 و 17 والعديد من المتغيرات المهندسة 18 و 19 و 20 مع خصائص مختلفة مثل حجم فوتوكرنت، حساسية الطيفية، حركية، الانتقائية الموجبة المتاحة. بينما في علم الأعصاب، سرس أإعادة استخدامها لتنشيط الخلايا وإطلاق أبس، كانت المضخات الميكروبية مدفوعة ضوء المضادات المتاحة فقط لإسكات الخلايا العصبية لسنوات. في عام 2014، أظهرت مجموعتان في وقت واحد أن سرس يمكن تحويلها إلى أنيون-ترانزلاتيوندودوبسينز (أكرس) عن طريق تغيير القطبية على طول المسود أيون إجراء المسام عن طريق الهندسة الجزيئية 9 ، 21 . وفي وقت لاحق، تم تحديد أكر الطبيعية في العديد من الطحالب كريبتوفيت 22 ، 23 ، 24 . الأهم من ذلك، تفعيل ضوء أكرس يتوسط تيارات الكلوريد في الخلايا العصبية البالغة السماح تثبيط نشاط الخلايا العصبية في شدة الضوء أقل بكثير من المضخات الميكروبية التي تنقل فقط رسوم واحدة لكل الفوتون استيعابها.
نشاط كر يمكن معالجتها مباشرة عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك من التيارات التي يسببها الضوء في خلايا HEK293. التصحيح المشبكوقد تم تطوير تقنية أصلا في أواخر 1970s 25 ومواصلة تحسينها من قبل هاميل وآخرون. ، مما يسمح لتسجيل كيان التيارات من خلية صغيرة (وضع خلية كاملة) مع ارتفاع القرار الحالي والتحكم المباشر من الجهد الغشاء 26 . تطبق هذه التقنية في ثقافة الخلية، وتوفر التحكم الدقيق في ظروف التسجيل الأيونية وكذلك الكهربائية، وتمكن من دراسة الانتقائية الأيونية جنبا إلى جنب مع المساهمة النسبية للأيونات إلى التيار الكلي. هنا نحن تجسد فحص أيون الانتقائية ل أنيون-ترانزلاتيونرودوبسين من بروتيوموناس سولكاتا ( بس ACR1) 22 ، 23 عن طريق تسجيل العلاقات الجهد الحالي تحت مختلف تركيزات كلوريد خارج الخلية لإثبات ارتفاع كلوريد تصرف.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد إمكانات عكس في ظروف الأيونية والكهربائية محددة يوفر معلومات عن الأنواع الأيونية المنقولة بعد تفعيل الضوء من شر. إذا تنوعت الأنواع الأيونية حصريا في وسط فسيولوجي معقد، وتحولت إمكانية الانعكاس التي تم الحصول عليها وفقا لإمكانية نيرنست النظرية، فإن هذا النوع من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مايلا ريه، ثارسانا ثارمالينجام وخاصة ألتينا كلاين للمساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (SFB1078 B2، FOR1279 SPP1665 إلى ف) ومجموعة المفاهيم الموحدة التميز في الحفز، ونيكات، بيج-نس (جف) و E4 (ف).
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -. Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
