This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Det siste tiåret har kanalrhodopsiner blitt uunnværlig i nevrovitenskapelig forskning, der de brukes som verktøy for ikke-invasiv manipulering av elektriske prosesser i målceller. I denne sammenheng er ion selektivitet av en kanalrhodopsin av særlig betydning. Denne artikkelen beskriver undersøkelsen av klorid-selektivitet for en nylig identifisert anion-ledende kanalhodopsin av Proteomonas sulcata via elektrofysiologiske patch-clamp-opptak på HEK293-celler. Forsøksprosedyren for måling av lysgatede fotokrenser krever en rask omskiftelig – ideelt monokromatisk – lyskilde koblet inn i mikroskopet av en ellers vanlig patch-clamp-oppsett. Preparative prosedyrer før forsøket er skissert med fremstilling av bufrede løsninger, overveielser på væskeforbindelsespotensialer, seeding og transfeksjon av celler og trekking av patchpipetter. Den faktiske opptak av strømspenningsforholdS for å bestemme reverseringspotensialene for forskjellige kloridkonsentrasjoner finner sted 24 timer til 48 timer etter transfeksjon. Til slutt analyseres elektrofysiologiske data i forhold til teoretiske hensyn til kloridledning.
Channelrhodopsins (ChR) er lette gatedjonskanaler som forekommer i øyepunktet av motile grønne alger, og fungerer som primære fotosensorer for fototaksier og fobiske responser 1 . Siden deres første beskrivelse i 2002 2 har ChRs banet vei for det fremvoksende feltet av optogenetikk og kan brukes i en rekke eksklusive celler, for eksempel innenfor skjelettmuskler, hjerte eller hjerne 3 , 4 , 5 . Ekspresjon av ChRs i målceller resulterer i lysstyrbar ionpermeabilitet av den respektive cellen. I en nevronkontekst tillater dette aktivering 6 , 7 , 8 eller inhibering 9 , 10 av potensialpotensial (AP) avfyring – avhengig av den utførte ion – med romlige og tidsmessigePresisjon av lys understreker hvordan ion-selektiviteten til en ChR-variant bestemmer dens optogenetiske anvendelse.
De første oppdagede ChRs fra Chlamydomonas reinhardtii og Volvox carteri er permeable mot protoner, men også til monovalente kationer som natrium, kalium og i mindre grad divalente kationer som kalsium og magnesium 11 , 12 , 13 . I dag har mer enn 70 naturlige kation-ledende kanalrhodopsiner (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 og flere konstruerte varianter 18 , 19 , 20 med forskjellige egenskaper som f.eks. Fotokurrensstørrelse, spektral følsomhet, kinetikk og kation selektivitet er tilgjengelig. Mens i nevrovitenskap, er CCR aBrukes til å aktivere celler og utløse AP, var lysdrevne mikrobielle pumper de eneste tilgjengelige antagonister for å silere nevroner i årevis. I 2014 viste to grupper samtidig at CCRer kan omdannes til anion-ledende kanalrhodopsiner (ACR) ved endring av polariteten langs den formodnede ionledende pore via molekylærteknikk 9 , 21 . Deretter ble naturlige ACRer identifisert i flere kryptofyte alger 22 , 23 , 24 . Viktigst er at lysaktivering av ACRer medierer kloridstrømmer i voksne neuroner som tillater inhibering av nevronaktivitet ved mye lavere lysintensiteter enn mikrobielle pumper som bare transporterer enkeltladninger per absorbert foton.
ChR-aktivitet kan adresseres direkte ved elektrofysiologiske patch-clamp-opptak av lysinducerte strømmer i HEK293-celler. LåsklemmenTeknikken ble opprinnelig utviklet på slutten av 1970-tallet og ble ytterligere forbedret av Hamill et al. , Slik at innspillingen av enheten av strømmer fra en liten celle (helcelle-modus) med høy strømoppløsning og direkte styring av membranspenningen 26 . Anvendt i cellekultur, gir denne teknikken nøyaktig kontroll over ioniske og elektriske opptakssituasjoner, og muliggjør å studere ionselektivitet sammen med det relative bidrag av ionene til totalstrømmen. Her eksemplifiserer vi undersøkelsen av ion selektivitet for anion-ledende kanalrhodopsin av Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via opptak av strømspenningsforhold under forskjellige ekstracellulære kloridkonsentrasjoner for å bevise høy kloridkonduktans.
Bestemmelse av reverseringspotensialer ved definerte ioniske og elektriske forhold gir informasjon om ionartene transportert etter lysaktivering av ChRs. Hvis utelukkende en ionart varieres i et komplekst fysiologisk medium og de oppnådde reverseringspotensialforskyvninger i henhold til det teoretiske Nernst-potensialet, er denne ionart den eneste transporterte.
For ChRs er reverseringspotensialforskyvninger vanligvis mindre uttalt enn forventet fra Nernst-ligningen på grunn av permeabilit…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Maila Reh, Tharsana Tharmalingam og spesielt Altina Klein for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av German Research Foundation (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 til PH) og Cluster of Excellence Unifying Concepts i Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) og E4 (PH).
HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
CsCl | Biomol | 2452 | |
EGTA | Roth | 3054 | |
FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
KCl | Roth | 6781 | |
MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
NaCl | Roth | 3957 | |
NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
Citric acid | Roth | 6490 | |
AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
Kanamycin | Roth | T832 | |
Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
Microforge | Custom made | Fire polishing | |
Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
Stirrer | IKA | RCT classic | |
Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
Osmometer | Vogel | OM 815 | |
Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
CO2 incubator | Binder | CB150 | |
Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
Recording chamber | Custom made | ||
Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |