Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins
Summary
This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.
Abstract
Durante la última década, los channelrhodopsins se hicieron indispensables en la investigación neurocientífica donde se utilizan como herramientas para manipular de manera no invasiva procesos eléctricos en células diana. En este contexto, la selectividad iónica de una canalrhodopsina es de particular importancia. En este artículo se describe la investigación de la selectividad del cloruro para una canalrhodopsina de Proteomonas sulcata conductora de aniones recientemente identificada mediante grabaciones electrofisiológicas de la placa de sujeción en células HEK293. El procedimiento experimental para la medición de fotocorrientes de luz-gated requiere una fuente de luz conmutable rápida – idealmente monocromática – acoplada en el microscopio de una instalación de parche-abrazadera de otro modo convencional. Se describen los procedimientos preparativos previos al experimento que incluyen la preparación de soluciones tamponadas, consideraciones sobre los potenciales de unión de lıquidos, siembra y transfección de células y extracción de las pipetas de parche. La grabación real de la relación tensión-corrienteS para determinar los potenciales de inversión para diferentes concentraciones de cloruro se produce 24 h a 48 h después de la transfección. Por último, los datos electrofisiológicos se analizan con respecto a las consideraciones teóricas de la conducción de cloruro.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) son canales de iones ligeros que se producen en el ojo de las algas verdes móviles, y sirven como fotosensores primarios para fototaxis y respuestas fóbicas [ 1] . Desde su primera descripción en 2002 [ 2] , ChRs han allanado el camino para el campo emergente de la optogenética y se puede aplicar en una variedad de células excitables, por ejemplo, dentro de los músculos esqueléticos, el corazón o el cerebro [ 3 , 4 , 5] . La expresión de ChRs en células diana da como resultado la permeabilidad iónica controlable por luz de la célula respectiva. En un contexto neuronal, esto permite la activación 6 , 7 , 8 o inhibición 9 , 10 del potencial de acción (AP) disparando – dependiendo del ión conducido – con el espacio y temporalPrecisión de la luz enfatizando cómo la selectividad iónica de una variante ChR determina su aplicación optogenética.
Los primeros ChRs descubiertos de Chlamydomonas reinhardtii y Volvox carteri son permeables a los protones, pero también a los cationes monovalentes como el sodio, el potasio y, en menor medida, a los cationes divalentes como el calcio y el magnesio 11 , 12 , 13 . Hoy en día, más de 70 canalrhodopsins (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 de conducción de cationes naturales y varias variantes 18 , 19 , 20 de ingeniería con diferentes propiedades tales como El tamaño de la fotocorriente, la sensibilidad espectral, la cinética y la selectividad del catión. Mientras que en neurociencia, CCRs aRe utilizados para activar las células y disparar APs, bombas microbianas impulsadas por la luz fueron los únicos antagonistas disponibles para silenciar las neuronas durante años. En 2014, dos grupos mostraron simultáneamente que CCRs pueden ser convertidos en anión-conductora channelrhodopsins (ACRs) por la alteración de la polaridad a lo largo de la putativo ión de conducción poros a través de ingeniería molecular 9 , 21 . Posteriormente, ACRs naturales se identificaron en varios criptofitos alga 22 , 23 , 24 . Más importante aún, la activación de luz de ACRs media las corrientes de cloruro en las neuronas adultas permitiendo la inhibición de la actividad neuronal a intensidades de luz mucho más bajas que las bombas microbianas que sólo transportan cargas únicas por fotón absorbido.
La actividad de ChR se puede abordar directamente mediante grabaciones electrofisiológicas de las corrientes inducidas por luz en las células HEK293. La abrazadera de parcheTécnica fue desarrollada originalmente a finales de los años setenta 25 y mejorada por Hamill et al. , Permitiendo el registro de la entidad de corrientes desde una célula pequeña (modo de célula completa) con alta resolución de corriente y control directo de la tensión de membrana 26 . Aplicada en cultivo celular, esta técnica proporciona un control preciso de las condiciones de grabación iónica y eléctrica y permite estudiar la selectividad de iones junto con la contribución relativa de los iones a la corriente total. Aquí se ejemplifica el examen de la selectividad iónica de la canalrhodopsina conductora de aniones de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 mediante el registro de las relaciones tensión-corriente en varias concentraciones de cloruro extracelular para demostrar una alta conductancia del cloruro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La determinación de los potenciales de inversión en condiciones iónicas y eléctricas definidas proporciona información sobre las especies de iones transportadas después de la activación de luz de ChRs. Si exclusivamente varía una especie iónica en un medio fisiológico complejo y el potencial de inversión invertido se desplaza según el potencial teórico de Nernst, esta especie iónica es la única transportada.
Sin embargo, para ChRs, los cambios potenciales de reversión suelen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam y especialmente Altina Klein por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) y el Cluster of Excellence Unifying Concepts en Catálisis, UniCat, BIG-NSE (JV) y E4 (PH).
Materials
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E.coli/ | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E.coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
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