Summary
Мы демонстрируем полуавтоматический радиохимический синтез [ 18 F] 3F4AP и процедуры контроля качества.
Abstract
3- [ 18 F] фтор-4-аминопиридин, [ 18 F] 3F4AP, представляет собой фторосодержащий аналог одобренного FDA лекарственного средства для лечения рассеянного склероза 4-аминопиридина (4AP). Это соединение в настоящее время исследуется как индикатор ПЭТ для демиелинизации. Недавно мы описали новую химическую реакцию для получения метафторированных пиридинов, состоящую из прямого фторирования N-оксида пиридина и использования этой реакции для радиохимического синтеза [ 18 F] 3F4AP. В этой статье мы продемонстрируем, как производить этот трассер с помощью автоматизированного синтезатора и собственного реактора гидрогенизации потока. Мы также показываем стандартные процедуры контроля качества перед выпуском радиоизмеряющего доклинического исследования изображений животных. Эта полуавтоматическая процедура может послужить основой для будущего производства [ 18 F] 3F4AP для клинических исследований.
Introduction
Способность прослеживать маломолекулярное лекарственное средство, неинвазивно действующее в организме человека, имеет большой потенциал для точной медицины. Среди методов молекулярной визуализации позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) имеет много благоприятных характеристик: высокая чувствительность ПЭТ-детекторов позволяет выявлять и количественно определять очень небольшие количества радиоактивного материала, а характеристики сканеров позволяют точно пространственное картирование локализации препарата 1 , 2 , 3 . Например, ПЭТ позволяет выявлять и локализовать опухоли и метастазы, основанные на уровне поглощения радиоактивного аналога глюкозы [ 18 F] FDG 4 . ПЭТ может также обеспечивать локализацию и количественную оценку специфических рецепторов мозга и их наполнение, которые могут быть полезными для диагностики и понимания неврологических и психических расстройств 5 . В целях развитияПредставляющее интерес соединение должно быть помечено изотопом, излучающим позитрон, как правило, 11 ° C или 18 ° F. Между этими двумя радиоизотопами 18 F имеет более продолжительный период полураспада (109 минут и 20,3 для 11 ° C) , Что позволяет создавать многодозовые и выездные производства. Тем не менее, добавление 18 F к молекуле может быть сложным. Маркировка 18 F требует быстрых реакций, совместимых с автоматизацией, освобождающей химика от непосредственного обращения с активностью и приема высокопоглощающих доз облучения.
Недавно мы описали использование N-оксидов пиридина в качестве предшественников для фторирования пиридинов и использование этой химии в радиохимическом синтезе [ 18 F] 3F4AP 6 , радиофторированного аналога одобренного FDA лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, 4- Аминопиридин (4АР) 7 , 8 , 9 . ThВ настоящее время изучается в качестве ПЭТ-трассера для демиелинизации 10 , 11 , 12 . В этой видео статье мы демонстрируем полуавтоматический синтез этого соединения с использованием синтезатора IBA Synthera (далее называемый «синтезатор») и собственного гидрогенизационного устройства. Синтез основан на реакции, показанной на фиг.1 . Подготовка к процедуре занимает приблизительно 1 час, радиоактивная метка и очистка 1,5 часа и процедуры контроля качества 0,5 часа.
Protocol
ВНИМАНИЕ: Все процедуры, связанные с использованием радиоактивных материалов, должны быть одобрены местным Управлением радиационной безопасности. При работе с радиоактивными материалами носить лабораторный халат и персональные лучевые знаки. Всегда используйте два слоя перчаток и проверяйте руки с помощью счетчика Гейгера после каждого шага, который включает в себя обработку радиоактивности. Если перчатки загрязнены радиоактивными отходами и замените наружные перчатки. Используйте соответствующее экранирование, минимизируйте время контакта с источником излучения и увеличьте расстояние.
1. За неделю до эксперимента: подготовка материалов
- Загрузите последовательность [ 18 F] 3F4AP: пользователи Synthera могут войти в базу данных пользователей (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) и загрузить файл последовательности для 3F4AP. Пользователям других синтезаторов может потребоваться написать собственный скрипт на основе последовательности шагов. Просмотрите аннотированную последовательность, чтобы ознакомиться сУчаствующих в синтезе.
- Убедитесь, что для синтеза достаточно газа. Синтезатор требует сжатого газа, гелия или азота. Он также требует сжатого воздуха> 75 psi. Убедитесь, что давление находится в пределах рекомендованного производителем.
- Подготовьте подвижную фазу ВЭЖХ: подготовьте 1 л 50 мМ фосфата натрия и 10 мМ триэтиламина. С помощью рН-метра доводят pH до 8,0 ± 0,1, добавляя по каплям насыщенный гидроксид натрия при перемешивании. Фильтруют раствор через 0,22 мкм фильтр bottletop и добавляют 5% объема этанола.
- Сухую посуду в духовке на ночь.
2. День эксперимента: до прибытия фтора-18
- Используя шприцы по 1 мл, заполните флакон с реагентами соответствующими реагентами. Для флаконов 2 и 3 используют высушенные в печи флаконы и безводные растворители, которые хранят в атмосфере аргона. Запечатайте флаконы с помощью обжимных уплотнений с помощью обжимного устройства.
- Заполните флакон 1 (диаметр 11 мм / объем 2 мл viAl) 400 мкл TBA-HCO 3 + 800 мкл ацетонитрила (MeCN).
- Заполните флакон 2 (флакон 13 мм / 4 мл) 50 мкл раствора предшественника 1,0 мг / мл + 450 мкл MeCN.
- Заполните флакон 3 (флакон 11 мм / 2 мл) 500 мкл MeCN.
- Заполните флакон 4 (13 мм / 4 мл флакон) с 4 мл 0,2% щавелевой кислоты в метаноле (МеОН).
- Применяют картриджи с твердой фазой QMA (сильные анионообменные) и Alumina-N. Используя шприц 10 мл, пропускают по 5 мл 8,4% NaHCO 3 через QMA, а затем 5 мл ультрачистой деионизированной воды типа I (18,2 МОм · см при 25ºC). Пропустите 5 мл сверхчистой воды, падающей через картридж из окиси алюминия, затем 5 мл MeOH + 0,2% щавелевой кислоты.
- Включите ВЭЖХ и установите колонку C-18 с 4 мл в минуту подвижной фазы в течение 30 мин.
- Загрузите новый патрон катализатора в держатель гид- роприемника и начните подачу 0,5 мл / мин 100% МеОН. SИ регулятора водорода до 50 фунтов на квадратный дюйм и кондиционирование картриджа в течение 15 минут ( рис. 2 ).
- Соберите интегрированный жидкостный процессор (IFP), вставив флаконы с 1-го по 4-й позиции, прикрепляя картриджи и сборный флакон, как показано на рисунке 3 . Прикрепите коллекционный флакон с вентиляционной иглой к выходной линии гидрогенератора.
- Запустите программное обеспечение синтезатора. Введите имя пользователя и пароль. Выполняйте проверку перед запуском синтезатора в соответствии с инструкциями производителя.
- Нажмите «Последовательности», а затем «Открыть», чтобы загрузить последовательность 3F4AP.
- Загрузите IFP, нажав кнопку «Загрузить» на экране. Введите имя файла для запуска и начните последовательность, нажав «Пуск». (Автоматический синтезатор автоматически остановится перед шагом загрузки 18 F).
- Наблюдайте, как синтезатор проходит стандартные шаги самопроверки (часть первая из последовательности). Посмотрите на осыпьN, чтобы убедиться, что нет предупреждений или предупреждений. Обратите внимание на звуки, так как синтезатор очищает линии и подогревает реакционный сосуд при подготовке к пробегу. Индикатор температуры должен подняться и остаться на уровне 65 ºC. Подождите сигнала (звуковой сигнал), указывающего, что синтезатор готов к передаче 18 F.
3. День эксперимента: 18 F Маркировка
- Удаленная передача желаемого количества циклотрона 18 F от циклотронной мишени до 18 F флакона. Проверьте количество радиоактивности и запишите его со временем доставки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если не используется прямая линия для 18 F - переноса, используйте предварительно заполненный шприц с иглой, прикрепленной для переноса активности в пробирку через перегородку. Количество исходной радиоактивности зависит от пределов, установленных Управлением радиационной безопасности и желаемым количеством конечного трассирующего вещества. Типичная величина колеблется между 50 и 500 мКи. - Следить за ходом синтеза во всей автоматизированной последовательности на экране компьютера.
- Смотрите передачу 18 F от флакона на QMA в течение 90 секунд. После захвата 18 F - на QMA он элюируется раствором TBA-HCO 3 (флакон 1). (Вторая часть последовательности)
- Контролируйте следы давления и температуры на синтезаторе, в то время как TBA 18 F высушивают при пониженном давлении (5 кПа) и нагревании (100ºС), после чего следуют дополнительные этапы высушивания и охлаждения. (Часть 3 последовательности)
- Наблюдайте за перемещением безводного MeCN (флакон 3) и раствора предшественника (флакон 2) в реактор и как он реагирует в течение 1 минуты при комнатной температуре. Раствор должен быть бесцветным или очень бледно-желтым. (Часть 4 последовательности)
- Следите за переносом щавелевой кислотыРаствора (флакон 4) в реактор. Наблюдайте, как раствор представляет собой давление, передаваемое из реактора через патрон из окиси алюминия-N в конечный продукт. (Часть 5 последовательности)
- В конце последовательности распечатайте отчет, извлеките IFP, отключите газовые баки и закройте программное обеспечение.
- При первом установлении процедуры измерьте радиоактивность в картридже с алюмооксидным алюминием и в сосуде для сбора, отдельно введя картридж и пробирку в калибратор дозы. Запишите активность и время измерения. Поместите использованный картридж в свинцовый контейнер для отходов. Поместите флакон для сбора в экранированный контейнер для транспортировки к следующему шагу.
- Используя 1-мл шприц с прикрепленной иглой 2 ", вручную переносите приблизительно 100 мкл образца промежуточного продукта в стандартный флакон для ВЭЖХ для контроля качества в процессе. Внесите 10 мкл этого образца в ВЭЖХ для оценки чистоты и Личность интермеДиатата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия ВЭЖХ: XDB 5 мкм, 9,4 х 250 мм C18-колонка. Поток 4 мл / мин. Подвижная фаза (50 мМ Na 2 HPO 4 , 10 мМ TEA, 5% EtOH). Изократический 15 мин.
4. День эксперимента: гидрирование
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Впрыскивание продукта в гидрогенизатор должно выполняться с соблюдением надлежащих мер предосторожности. Водородный газ должен быть надлежащим образом обработан и вентилирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: реактор гидрирования может быть подключен вместо колонки ВЭЖХ на синтезаторе и управляться с помощью программного обеспечения синтезатора.
- Настроить поток гидрогенизатора со скоростью 0,5 мл / мин путем запуска последовательности ВЭЖХ синтезатора. Вручную настройте давление водорода до 50 фунтов / кв. Дюйм.
- После завершения этапов маркировки и резкого охлаждения синтезатор перенесет раствор промежуточного продукта в контур гидрогенизатора / ВЭЖХ.
- Когда радиоактивный пик появляется на HPLC, переключите клапан сбора для сбора продукта. Измерьте радиоактивность сырого продукта, используя калибратор дозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неочищенный продукт должен быть введен в автоматизированную систему HPLC внутри горячей камеры. После очистки конечный продукт затем собирают и распределяют в асептическую горячую камеру с ламинарным потоком воздуха класса 5 по ISO в соответствии с правилами USP и FDA.
5. День эксперимента: очистка и подготовка дозы
- Внесите неочищенный продукт в ВЭЖХ и используйте автоматический сборщик фракций для сбора фракций, соответствующих пику конечного продукта. Каждая пробирка содержит 0,66 мл раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия ВЭЖХ: XDB 5 мкм, 9,4 х 250 мм C18-колонка. Поток 4 мл / мин. Подвижная фаза (50 мМ Na 2 HPO 4 , 10 мМ TEA, 5% EtOH). Изократический 15 мин. Соберите 4-15 мин. - Измерьте радиоактивность каждой фракции с помощью калибратора дозы и запишите ее. Объединение фракций с наибольшим количествомС радиоактивности (как правило, трубки 14-18).
- Нарисуйте раствор продукта с помощью шприца объемом 10 мл и пропустите образец через фильтр 0,22 мкм в стерильный флакон. Запишите количество радиоактивности, окончание времени синтеза и объема раствора на этикетке флакона. Это конечная доза для инъекций. Отложите 0,8 мл раствора для контроля качества.
6. День эксперимента: проверки качества (QC)
- Перед выпуском дозы:
Осмотрите дозу через свинцово-экранированное стекло. Раствор должен быть прозрачным, бесцветным и не содержать твердых частиц. - Радиохимическая идентичность:
- Для RadioTLC: нанесите каплю образца на пластину TLC бок о бок с эталонным стандартом. Прогон ТСХ-пластинки в ТСХ-камере с использованием 95% МеОН: 5% уксусной кислоты. Визуализируйте эталонный стандарт при УФ-освещении и отметьте его положение карандашом.
- Закрепите пластину ТСХ на этапе радиотелескопаИ рекордное время пика. Значения R f эталонного стандарта и радиоактивного пика должны соответствовать 5%.
- Для RadioHPLC: запустить 10 мкл дозы с эталонным стандартом и без него для ВЭЖХ. Время удерживания эталонного стандарта и радиоактивного пика должно совпадать. Один пик коэлюции должен быть виден на шиповатом образце.
- Для радиохимической чистоты: измерьте площадь под кривой для целевых пиков радиоприборов HHCH и радиоTLC. Площадь целевого пика должна составлять> 95% от площади для всех радиоактивных пиков вместе взятых.
- Для удельной радиоактивности: вычислить удельную радиоактивность как количество радиоактивности в пике (измеренное на этапе 5.2) по количеству массы, определенному по площади под кривой кривой УФ-ВЭЖХ, используя предварительно установленную калибровочную кривую. Удельная радиоактивность должна быть выше 50 мКи / мкмоль.
- Для остаточного анализа растворителя: измерьте количество остаточного растворителяTs (MeCN, MeOH) в дозе с использованием газовой хроматографии. Уровни растворителей должны быть <0,04% для ацетонитрила и <3000 м.д. для метанола. Количество EtOH должно быть менее 10% мас. / Об.
- Для испытания целостности стерильного фильтра (точка насыщения): подключите фильтр, используемый на этапе 5.3, к источнику азота, снабженному регулятором давления, и погрузите иглу в воду. Постепенно откройте газовый клапан, наблюдая за манометром. Фильтр должен выдерживать давление до 50 фунтов на квадратный дюйм без разрыва, о чем свидетельствует отсутствие потока пузырьков из иглы. Увеличьте давление выше 50 psi, пока из иглы не выйдет поток пузырьков. Запишите это давление, это давление разрыва, и оно должно быть> 50 psi.
- Для периода полураспада радионуклидов: измерьте радиоактивность продукта в двух временных точках ≥10 мин друг от друга в калибраторе дозы. Рассчитайте период полураспада, используя приведенное ниже уравнение. Период полураспада должен соответствовать 18 F в течение 5 минут (109 ± 5 мин):
T ½ = 0,693 t ÷ ln (A 1 / A 2 )
Где t - интервал между измерениями, A 1 , A 2 - активность, измеренная в каждой временной точке. - Для радионуклидной идентичности и чистоты: получить спектр гамма-излучения образца продукта, используя гамма-счетчик. Спектр должен иметь один фотопик с энергией 511 кэВ. В спектре не должно быть других фото-пиков.
- Для анализа эндотоксина: измерьте уровни эндотоксина, используя тест количественного определения хромогенного эндотоксина LAL. Уровни эндотоксина должны быть <1,75 EU / mL для 1:10 разбавленного продукта с конечным объемом продукта 10 мл.
- Задокументировать результаты каждого теста контроля качества. Освободите дозу для исследования на животных, только если все испытания прошли.
- Последующее высвобождение:
Для теста на стерильность: добавьте образец дозы как для жидкого тиогликолята, так и для триптиказыСоевый бульон. Через 14 дней на средствах массовой информации не должно наблюдаться роста.
7. День эксперимента: расчеты (таблица 1)
- Для скорректированного без распада радиохимического выхода (ndc RCY): вычислить RCK ndc как количество радиоактивности в конечном продукте по сравнению с исходной радиоактивностью.
- Для эффективности радиоактивного мечения: рассчитать выход мечения как отношение радиоактивности в колбе для сбора по сравнению с радиоактивностью в картридже с алюмооксидным алюминием (не включенное [ 18 F] F - ) и в пузырек для сбора.
- Для выхода гидрирования: рассчитать выход гидрирования в виде количества радиоактивности в желаемом пике по сравнению с радиоактивностью, введенной в ВЭЖХ.
- Для потерь фильтрации: вычисление фильтрации теряет как радиоактивность, остающуюся в фильтре и шприце над радиоактивностью перед фильтрацией.
Representative Results
Радиохимический синтез [ 18 F] 3F4AP включает два этапа ( рис. 1 ). Первый шаг выполняется полностью автоматическим способом с использованием блока синтеза ( рис. 3 ). Эта кассетная система использует четыре флакона для реагентов и один реакторный флакон и имеет управляемые компьютером клапаны, которые позволяют переносить и смешивать реагенты, а также нагревать, герметизировать и эвакуировать реактор. Кроме того, он поддерживает стандартные картриджи для твердофазной экстракции для разделения реагентов. Компьютерный интерфейс позволяет пользователям писать и изменять скрипты для запуска своих собственных синтезов. В случае [ 18 F] 3F4AP процедура синтеза состоит из пяти основных частей. В первой части синтезатор выполняет шаги самопроверки, предварительно подогревает реактор и ждет сигнала оператора, что 18 F готов. Во второй части фторид [ 18 F] переносятМ флакон 18 F в картридж для анионообмена и элюировали из картриджа в реактор с использованием раствора бикарбоната тетрабутиламмония. Третья часть, синтезатор азеотропно сушит [ 18 F] фторид в вакууме, чтобы сделать его реакционноспособным к нуклеофильному смещению. В четвертой части предшественник автоматически добавляется в реактор, где он реагирует с 18 F - для получения меченого соединения. Наконец, реакцию гасят добавлением 0,2% щавелевой кислоты в метаноле, что предотвращает разложение продукта, промотированное основанием, и окончательный раствор переносится давлением в сборную пробирку после прохождения через патрон из оксида алюминия-N, который захватывает любые Непрореагировавший фторид.
После завершения этапа маркировки можно взять небольшой образец для контроля качества. Запуск пробы в ВЭЖХ дает подтверждение того, что этап маркировки работал и оценкаОт радиохимической чистоты ( рис. 4 ). Кроме того, по УФ-трассе на ВЭЖХ массовое количество продукта может быть рассчитано с использованием предварительно установленной калибровочной кривой.
В то время как внутрипроцессная контроль качества ВЭЖХ выполняется, проводится вторая стадия реакции, восстановление N-оксидных и нитрогрупп. Для этого маркированный продукт автоматически инжектируют в собственное устройство гидрирования, основанное на методе, опубликованном Yoswathananont et al. 13 ( фиг. 2 ). Это устройство состоит из насоса ВЭЖХ и сжатого водородного бака, соединенного с устройством гидрирования потока через линии, снабженные обратными клапанами, чтобы предотвратить обратную струйную обработку. Продукт вытесняется насосом ВЭЖХ и смешивается с водородом в Т-образном смесителе. Затем эту смесь пропускают через маленький картридж, содержащий 10% катализатора Pd / C на твердой подложке. Пройдя через катаЛисту, полученный продукт затем собирают небольшими фракциями.
После гидрогенизации сырой продукт транспортируют и вручную вводят в ВЭЖХ для очистки конечного продукта ( фиг.5 ). Подвижная фаза ВЭЖХ была выбрана совместимой с инъекцией животного. Затем пики, соответствующие продукту, собирают и фильтруют-стерилизуют для получения конечной дозы.
Перед тем, как высвободить дозу для исследований изображений с помощью ПЭТ, проводятся тесты контроля качества. Эти испытания проводятся для того, чтобы убедиться, что индикатор является химическим объектом, которым он должен быть, и что он безопасен для инъекций. Некоторые из этих тестов могут не потребоваться для инъекций животным, но обычно рекомендуется следовать рекомендациям по использованию человека. Это гарантирует качество продукта, что повышает доверие к результатам и значительно повышает качествоОблегчает будущий переход к производству продукта для инъекций человека.
Таблица 1 содержит типичные параметры синтеза, включая начальную величину радиоактивности, исходное количество предшественника, выход для каждого шага, удельную активность, потери при фильтрации и т. Д. Эти параметры являются полезными для устранения неполадок с периодическими отказами и будущей оптимизации процедуры.
Рисунок 1. Схема реакции. Радиохимический синтез состоит из мечения с помощью обмена 19 F / 18 F с последующим катализируемым палладием гидрированием. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" />
Рисунок 2. Гидрирующая система. Схема устройства. Это устройство основано на публикации Yoswathananont et al. (Ссылка 13).
Рисунок 3. Схема интегрированного жидкостного процессора синтезатора (IFP) и реагентов. IFP содержит четыре флакона для реагентов, картридж QMA и один флакон с реактором. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Ультрафиолетовые и радиопеленгаторные индикаторы для промежуточного продукта. 3-фтор-4-нитропиридин-N-оксид имеет характеристическое поглощение при 313 нм.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Индикаторы ультрафиолетового и радиопеленгатора конечного продукта. 3-фтор-4-аминопиридин абсорбируется при 254 нм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| концепция | Среднее значение (n = 4) | SD | Комментарии |
| Начальная активность 18 F (мКи) | 148,0 | 44,9 | Начало синтеза |
| Количество предшественника (мкг) | 50 | Используйте 50 мкл 1,0 мг / мл сырья | |
| Активность, оставленная в QMA (mCi) | 3.0 | 1,7 | Измеряется в конце этапа маркировки |
| Выход радиоактивной метки | 29,7% | 6,3% | Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) |
| Радиохимическая чистота (ВЭЖХ-1) | > 98% | Из ВЭЖХ-1 QC | |
| Спекуляция акт. Промежуточное соединение (мКи / мкмоль) | 122,9 | 29,7 | Из ВЭЖХ-1 с использованием калибровочной кривой |
| Восстановление гидрирования (dc) | 74% | 9,0% | Исправлено для распада |
| ВЭЖХ-радиохимическая чистота (ВЭЖХ-2) | 90,7% | 2,9% | Вычислено по ВЭЖХ-2 |
| Эффективность сушки | > 98% | Исправлено для распада | |
| Фильтрация восстановления | 93,5% | 1,7% | Исправлено для распада |
| Объем дозы (мл) | 3,3 | Собирают фракции с наибольшей радиоактивностью | |
| Спекуляция акт. Конечный продукт (мКи / мкмоль) | 75,5 | 30,0 | Из ВЭЖХ-3 с использованием калибровочной кривой |
| Эффективность синтеза | 8,5% | 3,6% | Не-распад исправлен |
| Время синтеза (мин) | 104 | 11,2 |
Таблица 1. Параметры радиохимического синтеза.
| Общие проблемы | Возможные причины и решения |
| [ 18 F] фторид эффективно не элюируют из QMA | · TBA-HCO 3 был подготовлен неправильно. Обеспечьте достаточную концентрацию. |
| · Есть утечки в TBA-HCO 3 флакона. Убедитесь, что обжимное уплотнение затянуто, а перегородка не проколота перед установкой на IFP. | |
| · TBA-HCO 3 не находится в хорошем состоянии. Закажите новую партию. | |
| Низкий уровень маркировки | · В растворе предшественника присутствует влага. Сухой предшественник и растворители. |
| • Слишком низкая температура. | |
| Реакционный раствор желтый | · Продукт разлагается из-за основания. Используйте меньше TBA-HCO 3 . |
| · Существует tМного предшественника. Используйте меньше предшественников. | |
| · Слишком мало растворителя для количества 18 F - . Используйте больше растворителя. | |
| Дополнительные пики на радио HPLC | · Замещают нитрогруппу: уменьшают температуру реакции или сокращают время реакции. |
| Реакция гидрогенизации не работает | · Катализатор плохой. Используйте новый картридж. |
| · Поток слишком быстрый и не позволяет обеспечить достаточный контакт между катализатором и подложкой. Уменьшить поток. | |
| · Давление водорода слишком низкое. Увеличьте давление H 2 . | |
| Во время процедуры значительно увеличивается давление водорода | · Целостность картриджа скомпрометирована, а сплошная поддержка засоряет линии. Остановите поток и отключите газ. Пусть радиоактивность распадется. Удалите каталитический картридж и промойте систему. ПоложитьНовый картридж. |
| Выход гидрирования низкий | · Слишком много примесей, конкурирующих за катализатор (MeCN, щавелевая кислота). Уменьшить количество примесей или увеличить массу предшественника (Предупреждение: увеличение количества прекурсоров уменьшит удельную активность). |
| Низкое извлечение радиоактивности на стадии гидрогенизации | · В системе имеется утечка. Проверьте на наличие протечек и обратную промывку в водородной линии. |
| · Соединение является дефторирующим в реакторе. Оцените различные условия реакции (давление, температура, расход и т . Д.). | |
| Во время фильтрации теряется слишком много радиоактивности | · Смочите фильтр перед использованием. |
| · Используйте фильтр с более низким мертвым объемом. | |
| Пик конечного продукта в ВЭЖХ выглядит шире | · Слишком большой объем введенного. Введите нижний amр а ф. Используйте колонку с большим диаметром. |
| · Колонка плохо кондиционирована. Уточните столбец как минимум для 30 томов столбцов. | |
| · PH подвижной фазы низкий. Убедитесь, что pH ≥ 8. | |
| · Столбец не в хорошем состоянии. Заменить столбец. Используйте колонку, совместимую с основным pH. |
Таблица 2. Руководство по устранению неполадок.
Discussion
Для подготовки трасс ПЭТ требуется эффективная маркировка с минимальным вмешательством пользователя для сведения к минимуму радиационного облучения 14 . Здесь мы описали первую полуавтоматическую процедуру для радиохимического синтеза [ 18 F] 3F4AP, исследуемого в настоящее время ПЭТ-трассера для демиелинизации изображений. Этот полуавтоматический метод производит радиоизмерчитель с высокой степенью чистоты и достаточной удельной активностью для исследований на животных. Предварительные методы синтеза этого соединения основаны на ручном синтезе 6 , который значительно ограничивает количество радиоактивного индикатора, который может быть получен. Наличие автоматизированного метода синтеза также обеспечивает более воспроизводимые урожаи и облегчает перенос процедуры в другие лаборатории с аналогичным оборудованием. Будущие попытки полностью автоматизировать эту процедуру будут способствовать получению трассера в больших количествах для исследований на крупных животных или людей.
19 F для 18 F для включения радиоизотопа в интересующую молекулу. Преимущества этой реакции заключаются в том, что она является быстрой и дает почти исключительно желаемый продукт без необходимости проведения потенциально продолжительной стадии очистки для удаления избытка предшественника. Одно ограничение использования реакций фторид-обмена для мечения, таких как используемое здесь, состоит в том, что из-за начальной массы холодного соединения конечная удельная активность, определяемая как количество радиоактивности в мКи по количеству соединения в мкмоль, может быть ограничена. В наших стандартных условиях, начиная с 100-200 мКи 18 F - и 50 мкг прекурсора, типичная удельная активность в конце синтеза составляет до 100-200 мКи / мкмоль, что, по-видимому, достаточно для доклинических исследований по визуализации ПЭТ , Тем не менее, удельная активность может улучшиться за счет увеличения стартовой суммы для 18 F - 15 , 16 .
Как и во всех радиохимических синтезах ПЭТ-трассеров, очень важно быстро работать, чтобы свести к минимуму радиоактивный распад. Также важно свести к минимуму время обращения с радиоактивными материалами, использовать надлежащее экранирование и максимально увеличить расстояние между радиоактивным материалом и пользователем, чтобы свести к минимуму радиационное облучение. Эти аспекты особенно важны во второй половине протокола (очистка и контроль качества), в которых пользователю приходится вручную вводить раствор в ВЭЖХ, собирать фракции и фильтровать конечный продукт.
Как и во всех радиохимических синтезах ПЭТ-трассеров, очень важно быстро работать, чтобы mНейтрализовать радиоактивный распад. Также важно свести к минимуму время обращения с радиоактивными материалами, использовать надлежащее экранирование и максимально увеличить расстояние между радиоактивным материалом и пользователем, чтобы свести к минимуму радиационное облучение. Эти аспекты особенно важны во второй половине протокола (гидрирование и очистка), в которых пользователь должен вручную вводить раствор в гидрогенизатор, собирать фракции, настраивать процедуру сушки, повторно растворять продукт в буфере и фильтровать его. Во время стадии фильтрации легко потерять большое количество радиоактивного материала в стенках флаконов. Таким образом, важно попытаться собрать всю жидкость перед фильтрацией. Использование большего количества буфера для растворения может улучшить выход извлечения, но его использование не рекомендуется, поскольку для этого потребуется впрыскивать больший объем в ВЭЖХ, вызывая увеличение пика и увеличение объема конечной дозы.
Для устранения неполадокОптимизация процедуры важна для отслеживания урожайности каждого шага. Для большинства этапов это делается просто путем измерения количества радиоактивности до и после любого шага. В случае реакции выходы можно рассчитать путем количественного определения пиков ВЭЖХ. В таблице 1 в разделе результатов показаны типичные выходы для каждого шага. В таблице 2 ниже перечислены многие из часто встречающихся сбоев с возможными причинами отказа и способы их устранения.
Наконец, хотя описанная здесь процедура специфична для синтеза [ 18 F] 3F4AP, общий процесс работы и многие отдельные стадии являются общими для синтеза других соединений 17 . В этой статье мы также продемонстрировали типичные тесты QC, выполненные на любом PET-трассировщике.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан грантами NIH / NIBIB 1K99EB020075 Педро Бругароласу и премией Инновационного фонда Чикагской инновационной биржи Брайану Попко и Педро Бругароласу. Брайан Попко с благодарностью признается за его наставничество и финансовую поддержку проекта. Профессор Чин-Ту Чен и Интегрированный Исследовательский Ресурс Исследования Изображения Животных Чикагского Университета признаны за щедрое совместное использование лабораторного пространства и оборудования. IBA признана за спонсирование открытого доступа к этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclotron produced [18F]fluoride | House supplied/Zevacor | IBA Cyclone 18 | 100-200 mCi |
| Integrated fluid processor for production FLT/FDG | ABX | K-2715SYN | Cassette used for nucleophilic substitution |
| Anhydrous acetonitrile | Janssen | 36431-0010 | Transfer under nitrogen |
| Methanol | Janssen | 67-56-1 | |
| ultrapure water | house supplied | Millipore MilliQ system | |
| TBA-HCO3 | ABX | 808.0000.6 | abx.de |
| QMA | Waters | WAT023525 | Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water |
| Sodium bicarbonate | ABX | K-28XX.03 | Prefilled 5 mL syringes |
| Alumina-N | Waters | WAT020510 | Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-) |
| 3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide | Synthonix | 76954-0 | Store in desicator. Precursor |
| 3-fluoro-4-aminopyridine | Sigma Aldrich | 704490-1G | Reference standard |
| Oxalic acid | Sigma Aldrich | 75688-50G | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S80191-1 | |
| Triethyl amine | Fisher Scientific | 04885-1 | |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | USP |
| Final product vial | ABX | K28XX.04 | |
| Millex Filter Syringe | Millex | SLGVR04NL | |
| 10% Pd/C cartridge | Sigma Aldrich | THS-01111-12EA | |
| 11 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 03-250-618, 06-451-117, or equivalent | |
| 13 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 06-718-992, 06-718-643, or equivalent | |
| HPLC vials | Fisher Scientific | 03-391-16, 03-391-17, or equivalent | |
| SEMIPREP C18 column | Agilent | 990967-202 | |
| V-vials | Alltech | ||
| Syringes: 1, 3, 10 mL | Fisher Scientific | 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent | |
| Compressed gases: N2, He, H2 | Airgas | UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent | |
| TLC plates | Sigma Aldrich | Z193275, or equivalent | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synthera automated synthesizer | IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com | Synthera, 250.001 | Automatic synthesis unit |
| In-house hydrogenator | See picture | See text description | |
| Hot cells | Comecer | For manipulating radioactive materials | |
| RadioTLC scanner | Eckert and Ziegler | For handling sterile materials | |
| HPLC | Dionex | Ultimate 3000 | |
| Dose calibrator | Capintec | CRC15 | Or equivalent |
| Gamma counter | Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 | CRC 15, PET-CRC25, or equivalent | For measuring radioactivity |
| Personal dosimeters | Packard | Cobra II | For measuring gamma spectrum |
| Personal radiation badges and rings | Atlantic Nuclear | Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent | |
| Rotavap + vacuum pump | Landauer | ||
| Lead pigs + syringe shields | Heidolph | Or equivalent | |
| Geiger counter | Pinestar | ||
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent |
References
- Valk, P. E. Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , Springer. (2003).
- Phelps, M. E. PET: molecular imaging and its biological applications. , Springer. (2004).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A.
- Oriuchi, N., et al. Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).
- Heiss, W. D., Herholz, K.
- Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -H., DeJesus, O. Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides. Chemical Communications. , (2016).
- Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
- Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).
- Goodman, A. D., et al. Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial. Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).
- Brugarolas, P., et al. Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , Amer Chemical Soc. (2016).
- Brugarolas, P., et al. Development of a PET tracer for MS. J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).
- Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, Suppl 3. 493 (2015).
- Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C. Chem Comm. (1), 40-42 (2005).
- Stöcklin, G., Pike, V. W. Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, Springer Science & Business Media. (1993).
- Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
- Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
- Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , Wiley. (2012).
![Автоматизированный радиохимический синтез [<sup> 18</sup> F] 3F4AP: новый ПЭТ-трассер для визуализации демиелинизирующих заболеваний](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/55537.jpg)
