Summary
Vi demonstrerer halvautomatisk radiokjemisk syntese av [ 18 F] 3F4AP og kvalitetskontrollprosedyrer.
Abstract
3- [18F] fluor-4-aminopyridin, [18F] 3F4AP, er en radiofluorert analog av det FDA-godkjente legemidlet for multippel sklerose 4-aminopyridin (4AP). Denne forbindelsen er for tiden undersøkt som en PET-sporer for demyelinering. Vi har nylig beskrevet en ny kjemisk reaksjon for å produsere metafluorerte pyridiner som består av direkte fluorering av et pyridin-N-oksyd og utnyttelsen av denne reaksjonen for den radiokjemiske syntese av [18F] 3F4AP. I denne artikkelen demonstrerer vi hvordan du produserer denne sporen ved hjelp av en automatisert syntetisator og en interngjorte hydrogeneringsreaktor. Vi viser også standardkvalitetskontrollprosedyrene som er utført før utgivelsen av radiotraceren for prekliniske dyrbildningsstudier. Denne semi-automatiserte prosedyren kan tjene som grunnlag for fremtidig produksjon av [ 18 F] 3F4AP for kliniske studier.
Introduction
Evnen til å spore et lite molekylær legemiddel ikke-invasivt i menneskekroppen har stort potensial mot presisjonsmedisin. Blant molekylære bildebehandlingsteknikker har positronutslippstomografi (PET) mange gunstige egenskaper: PET-detektorens høy følsomhet tillater deteksjon og kvantifisering av svært små mengder radioaktivt materiale, og skannernes egenskaper tillater nøyaktig romlig kartlegging av stofflokalisering 1 , 2 , 3 . For eksempel tillater PET deteksjon og lokalisering av tumorer og metastaser basert på opptaksnivået av en radioaktiv glukoseanalog, [ 18 F] FDG 4 . PET kan også gi lokalisering og kvantifisering av spesifikke hjerne-reseptorer og deres belegg som kan være verdifulle for å diagnostisere og forstå nevrologiske og psykiatriske lidelser 5 . For å kunne utvikle segEt lite molekyl PET-spor, må forbindelsen av interesse merkes med en positron-emitterende isotop, typisk 11 C eller 18 F. Mellom disse to radioisotoper har 18 F en lengre halveringstid (109 min vs 20,3 i 11 C) , Som tillater produksjon av flere doser og offsite. Likevel, å legge 18 F til et molekyl kan være utfordrende. 18 F-merking krever raske reaksjoner som er kompatible med automatisering som lindrer kjemikeren av direkte håndtering av aktiviteten og mottar høyt absorberte strålingsdoser.
Vi har nylig beskrevet bruken av pyridin-N-oksider som forløpere for fluorering av pyridiner og bruken av denne kjemi i den radiokjemiske syntesen av [18F] 3F4AP6, en radiofluorert analog av FDA-godkjent legemiddel for multippel sklerose, 4- Aminopyridin (4AP) 7 , 8 , 9 . thEr en ny radiotracer for tiden undersøkt som en PET-sporer for demyelinisering 10 , 11 , 12 . I denne videoartikkelen demonstrerer vi den halvautomatiske syntesen av denne forbindelsen ved å bruke en IBA Synthera Synthesis Unit (heretter referert til som "synthesizer") og en egengjorte hydrogeneringsanordning. Syntesen er basert på reaksjonen vist i figur 1 . Forberedelse av prosedyren tar ca. 1 time, radiomerkning og rensing 1,5 timer og kvalitetskontrollprosedyrer 0,5 timer.
Protocol
FORSIKTIG: Alle prosedyrer som involverer bruk av radioaktive materialer, må godkjennes av det lokale kontoret for strålingssikkerhet. Når du arbeider med radioaktive materialer, skal du ha et laboratoriejakke og personlige strålebriller. Bruk to lag med hansker til enhver tid, og kontroller hendene med en Geiger-teller etter hvert trinn som innebærer håndtering av radioaktivitet. Hvis hanskene er forurenset med radioaktivitet, kassere og bytt ut ytre hansker. Bruk passende skjerming, minimer tid i kontakt med strålekilden og maksimere avstanden.
1. En uke før eksperiment: Forberedelse av materialer
- Last ned [ 18 F] 3F4AP-sekvens: Synthera-brukere kan logge inn på Brukerdatabasen (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) og laste ned sekvensfilen for 3F4AP. Brukere av andre syntetiserere må kanskje skrive eget skript basert på trinnsekvensen. Bla gjennom den merkede sekvensen for å bli kjent med sTeps involvert i syntesen.
- Sørg for at det er nok gass til syntesen. Syntetiseringsapparatet krever komprimert gass, enten helium eller nitrogen. Det krever også> 75 psi trykkluft. Sørg for at trykket er innenfor det anbefalte av produsenten.
- Klargjør HPLC mobil fase: lag 1 l 50 mM natriumfosfat og 10 mM trietylamin. Ved å bruke en pH-meter justerer du pH til 8,0 ± 0,1 ved å tilsette dråpevis mettet natriumhydroksyd under omrøring. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,2 μm flaskefilter og tilsett 5% volum etanol.
- Tørk glass i ovnen over natten.
2. Eksperimentdag: Før Fluor-18 kommer
- Bruk 1 ml sprøyter, fyll reagensflasker med de aktuelle reagensene. For hetteglass 2 og 3 bruk ovn-tørkede ampuller og vannfrie løsningsmidler holdt under argon. Tett hetteglassene med krympepakninger med en krympe.
- Fyll hetteglass 1 (11 mm diameter / 2 ml volum viAl) med 400 ul TBA-HCO3 + 800 ul acetonitril (MeCN).
- Fyll hetteglass 2 (13 mm / 4 ml hetteglass) med 50 μl forløpsløsning 1,0 mg / ml + 450 μl MeCN.
- Fyll hetteglass 3 (11 mm / 2 ml hetteglass) med 500 ul MeCN.
- Fyll hetteglass 4 (13 mm / 4 ml hetteglass) med 4 ml 0,2% oksalsyre i metanol (MeOH).
- Tilstand QMA (sterk anionbytter) og Alumina-N fastfase-ekstraksjonspatroner. Ved å bruke en 10 ml sprøyte, passere 5 ml 8,4% NaHCO 3 dropwise gjennom QMA etterfulgt av 5 ml ultralyd deionisert Type I vann (18,2 ΜΩ • cm ved 25 ºC). Pass 5 ml uoppløselig vann dråpevis gjennom aluminium-N-kassett fulgt av 5 ml MeOH + 0,2% oksalsyre.
- Slå på HPLC og beting C-18-kolonnen med 4 ml per minutt mobilfase i 30 minutter.
- Legg en ny katalysatorpatron på hydrogenatorpatronholderen og start en strøm på 0,5 ml / min 100% MeOH. SEt hydrogenregulatoren til 50 psi og still patronen i 15 minutter ( figur 2 ).
- Monter den integrerte væskeprosessoren (IFP) ved å introdusere hetteglassene 1 til 4 i deres posisjoner, feste blekkpatronene og oppsamlingsflasken som vist på figur 3 . Fest et oppsamlingshett med en ventilasjonsnål til hydrogenatorens utgangslinje.
- Start synthesizer-programvaren. Skriv inn innlogging og passord. Utfør pre-run sjekker på synthesizer i henhold til produsentens instruksjoner.
- Klikk på "Sequences" og deretter "Open" for å laste 3F4AP sekvensen.
- Legg inn IFP ved å klikke på "Load" knappen på skjermen. Skriv inn et filnavn for løp og start sekvensen ved å klikke på "Start". (Den automatiserte synthesizer vil automatisk pause før 18 F lastingstrinnet.)
- Se når synthesizer går gjennom rutinene selvkontrollerende trinnene (del en av sekvensen). Se på screeN for å sikre at det ikke er noen advarsler eller alarmer. Vær oppmerksom på lydene som syntetisereren spyler linjer og forvarmer reaksjonsbeholderen som forberedelse for løp. Temperaturindikatoren skal stige og forbli ved 65 ºC. Vent på signalet (auditiv pip) som indikerer at synthesizer er klar for 18 F-overføringen.
3. Eksperimentdag: 18 F-merking
- Fjern eksternt ønsket mengde syklotron-produsert 18 F fra syklotron-målet til 18 F-hetteglass. Kontroller mengden radioaktivitet og registrer den med leveringstidspunktet.
MERK: Hvis du ikke bruker en direkte linje for 18 F-overføring, bruk en ferdigfylt sprøyte med en nål som er festet for å overføre aktiviteten til hetteglasset gjennom septum. Mengden av startradioaktivitet avhenger av grensene fastsatt av Strålingssikkerhetskontoret og ønsket mengde sluttspor. Typiske mengder mellom 50 og 500 mCi. - Overvåk utviklingen av syntesen gjennom hele den automatiserte sekvensen på skjermen.
- Se overføringen 18 F fra hetteglasset til QMA i 90 s. Etter fangst 18 F - på QMA elueres den med TBA-HCO 3 -oppløsning (hetteglass 1). (Del to av sekvensen)
- Overvåk trykk- og temperatursporene på syntetisatoren mens TBA 18 F tørkes under redusert trykk (5 kPa) og oppvarming (100 ºC), etterfulgt av ekstra tørking og nedkjøling. (Del 3 av sekvensen)
- Se overføringen av vannfri MeCN (hetteglass 3) og forløperoppløsning (ampulle 2) til reaktoren og hvordan det reagerer i 1 min ved romtemperatur. Løsningen skal være fargeløs eller svært svakt gul. (Del 4 av sekvensen)
- Se overføringen av oksalsyreOppløsning (hetteglass 4) til reaktoren. Se ettersom løsningen er trykket overført fra reaktoren gjennom alumina-N-patron til det ferdige produktets hetteglass. (Del 5 av sekvensen)
- På slutten av sekvensen, skriv ut rapporten, skyt ut IFP, avslutt bensintankene, og lukk programvaren.
- Mens du først oppretter prosedyren, må du måle radioaktiviteten i aluminiumoksyd-N-patronen og oppsamlingsflasken ved å sette inn patronen og hetteglasset separat i dosekalibratoren. Ta opp aktiviteten og tidspunktet for måling. Plasser den brukte patronen i en avfallsbeholder. Plasser oppsamlingsflasken i en skjermet beholder for transport til neste trinn.
- Ved å bruke en 1 ml sprøyte med en 2-tommers nål festet, overfører man ca. 100 μL prøve av mellomproduktløsningen til et standard HPLC-hetteglass for kvalitetskontroll. Prosess 10 μL av denne prøven inn i HPLC for å evaluere renheten og Identitet av intermeDiatforbindelse.
MERK: HPLC betingelser: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 kolonne. Strøm 4 ml / min. Mobil fase (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisk 15 min.
4. Eksperimentdag: hydrogenering
FORSIKTIG: Injeksjon av produktet i hydrogenatoren må gjøres ved å bruke riktige beskyttelsesforanstaltninger. Vanngassen må håndteres og ventileres ordentlig.
MERK: hydrogeneringsreaktoren kan kobles i stedet for HPLC-kolonnen på syntetiseringsapparatet og kontrolleres ved hjelp av synthesizer-programvaren.
- Sett opp hydrogenatorstrømmen ved 0,5 ml / min ved å starte syntetiserings-HPLC-sekvensen. Manuell oppsett av hydrogentrykk til 50 psi.
- Etter ferdigstillelse av merking og slokkingstrinn vil syntetisatoren overføre mellomproduktløsningen til hydrogenator / HPLC-sløyfe.
- Når den radioaktive toppen vises på HPLC-programvare veksle oppsamlingsventilen for å samle produktet. Mål radioaktivitet av råprodukt ved hjelp av en dosekalibrator.
MERK: Råproduktet skal injiseres i et automatisert HPLC-system inne i en varmecelle. Etter rensing oppsamles sluttproduktet og dispenseres i en aseptisk ISO klasse 5 laminar luftstrømmen varmcelle i henhold til USP og FDA forskrifter.
5. Eksperimentdag: Rensing og preparering av dosen
- Injiser råprodukt i HPLC og bruk den automatiserte fraksjonssamleren til å samle fraksjonene som tilsvarer sluttproduktet topp. Hvert rør inneholder 0,66 ml løsning.
MERK: HPLC betingelser: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 kolonne. Strøm 4 ml / min. Mobil fase (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisk 15 min. Samle 4-15 min. - Mål radioaktiviteten til hver fraksjon ved å bruke en dosekalibrator og ta opp den. Kombiner fraksjonene med høyest beløpS av radioaktivitet (typisk rør 14-18).
- Tegn produktløsningen med en 10 ml sprøyte og send prøven gjennom 0,22 μm filter i et sterilt hetteglass. Ta opp mengden radioaktivitet, slutt på syntesetid og oppløsningsvolum på hetteglasset. Dette er den endelige dosen til injeksjon. Legg til side ~ 0,8 ml av løsningen for kvalitetskontrolltester.
6. Eksperimentdag: Kvalitetskontroll (QC) -test
- Før doseutgivelse:
Kontroller dosen gjennom blybeskyttet glass. Løsningen må være klar, fargeløs og fri for partikler. - Radiokjemisk identitet:
- For RadioTLC: Spot en dråpe av prøven på en TLC plate side ved side med referansestandarden. Kjør TLC plate på et TLC kammer ved bruk av 95% MeOH: 5% eddiksyre. Visualiser referansestandarden under UV-belysning og merk posisjonen med blyant.
- Tape TLC-platen til scenen av radioTLC-skannerenEr og rekordtid på toppen. Rf- verdier av referansestandard og radioaktive topp må samsvare innen 5%.
- For RadioHPLC: Kjør 10 μL av dosen med og uten referansestandarden på HPLC. Retensjonstid for referansestandarden og den radioaktive toppen må samsvare. En enkelt coelution peak må ses på spiked prøven.
- For radiokjemisk renhet: måle området under kurve for radioHPLC og radioTLC-måltoppene. Måletoppen må være> 95% av arealet for alle radioaktive topper kombinert.
- For den spesifikke radioaktiviteten: Beregn den spesifikke radioaktiviteten som mengden av radioaktivitet i toppen (målt i trinn 5.2) over massebeløpet bestemt fra området under kurven til UV HPLC-sporet ved å anvende en forhåndsbestemt kalibreringskurve. Den spesifikke radioaktiviteten må være høyere enn 50 mCi / μmol.
- For gjenværende løsningsmiddelanalyse: måle mengden gjenværende solvensTs (MeCN, MeOH) i dosen ved bruk av gaskromatografi. Løsningsmiddelnivåene må være <0,04% for acetonitril og <3000 ppm for metanol. Mengden EtOH må være mindre enn 10% vekt / volum.
- For den sterile filterintegritetstesten (boblepunkt): Koble filteret som ble brukt i trinn 5.3 til en nitrogenforsyning utstyrt med trykkregulator og senke nålen i vann. Åpne gassventilen gradvis mens du ser på trykkmåleren. Filteret skal tåle trykk på opptil 50 psi uten å sprekke som det fremgår av mangel på en strøm av bobler fra nålen. Øk trykket utover 50 psi til en strøm av bobler kommer ut av nålen. Ta opp dette trykket, det er burstrykket, og det må være> 50 psi.
- For halveringstiden for radionuklid: måle radioaktiviteten til produktet ved to tidspunkter ≥ 10 min fra hverandre i en dose kalibrator. Beregn halveringstiden ved å bruke ligningen nedenfor. Halveringstiden må samsvare med 18 F til 5 minutter (109 ± 5 min):
T ½ beregnet = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 )
Hvor t er intervallet mellom målingene og A 1 , A 2, måles aktiviteten målt ved hvert tidspunkt. - For den radionuklidiske identiteten og renheten: oppnå y-strålespektret av en prøve av produktet ved å bruke en gammatteller. Spekteret skal utgjøre en enkelt foto-topp ved en energi på 511 keV. Det bør ikke være andre fotopunkter i spekteret.
- For endotoxinanalysen måles endotoxinnivåene ved bruk av en LAL-kromogen endotoxin-kvantitasjonstest. Endotoksinnivåer må være <1,75 EU / ml for et 1:10 fortynnet produkt med et sluttproduktvolum på 10 ml.
- Dokumentere resultatene fra hver QC-test. Bare slipp dosen til dyreforsøk dersom alle tester passerte.
- Utslipp etter dosering:
For sterilitetstesten: Tilsett et utvalg av dosen til både fluidtioglykolat og tryptikaseSoya buljong. Ingen vekst må ses på media etter 14 dager.
7. Eksperimentdag: Beregninger (Tabell 1)
- For ikke-forfall-korrigert radiokjemisk utbytte (ndc RCY): beregne ndc RCY som mengden av radioaktivitet i sluttproduktet over startradioaktiviteten.
- For radiomarkeringseffektiviteten: Beregn merkingsutbyttet som forholdet mellom radioaktivitet i oppsamlingsflasken over radioaktivitet i aluminiumoksyd-N-patronen (ikke-inkorporert [ 18 F] F-) og oppsamlingsflasken.
- For hydrogeneringsutbyttet: beregne hydrogeneringsutbyttet som mengden av radioaktivitet i den ønskede topp over radioaktiviteten injisert i HPLC.
- For filtreringstapene: Kalkulere filtrering mister som radioaktiviteten som forblir i filteret og sprøyten over radioaktivitet før filtrering.
Representative Results
Den radiokjemiske syntesen av [18F] 3F4AP består av to trinn ( Figur 1 ). Det første trinnet utføres på en fullautomatisk måte ved hjelp av syntesenheten ( figur 3 ). Dette kassettbaserte systemet bruker fire reagenshetteglass og en reaktorhetteglass og har datastyrte ventiler som tillater overføring og blanding av reagenser, samt oppvarming, trykk og evakuering av reaktoren. I tillegg støtter den standard fastfase-ekstraksjonspatroner for separering av reagenser. Datagrensesnittet gir brukere mulighet til å skrive og modifisere skript for å kunne kjøre egne syntheser. I tilfelle av [18F] 3F4AP består synteseprosedyren av fem grunnleggende deler. I første del utfører synthesizeren selvkontroll, forvarmer reaktoren og venter på operatørens signal om at 18 F er klar. Under den andre delen overføres [ 18 F] fluoridet froM 18 F-hetteglasset i anionbytterpatronen og eluert fra patronen inn i reaktoren ved å bruke et oppløsning tetrabutylammoniumbikarbonat. Den tredje delen tørker syntetisatoren azeotropisk [18F] fluoridet under vakuum for å gjøre det reaktivt mot nukleofil forskyvning. I fjerde del blir forløperen automatisk lagt til reaktoren der den reagerer med 18 F - for å generere den merkede forbindelsen. Til slutt stoppes reaksjonen ved tilsetning av 0,2% oksalsyre i metanol, som forhindrer baseprøvet dekomponering av produktet, og den endelige oppløsningen overføres til oppsamlingshetten etter at den har passert gjennom en aluminiumoksyd-N-patron som feller noen Uomsatt fluorid.
Etter at merketrinnet er ferdig, kan en liten prøve tas for kvalitetskontroll. Å kjøre et utvalg på HPLC gir bekreftelse på at merketrinnet arbeidet og en estimatPå den radiokjemiske renheten ( figur 4 ). Også fra UV-sporet på HPLC kan massemengden av produktet beregnes ved hjelp av en forhåndsbestemt kalibreringskurve.
Mens HPLC i prosesskvalitetskontroll kjører, utføres det andre reaksjonstrinnet, reduksjon av N-oksyd- og nitrogruppene. For å gjøre dette injiseres det merkede produktet automatisk i en egen hydrogeneringsanordning basert på metoden publisert av Yoswathananont et al. 13 ( figur 2 ). Denne enheten består av en HPLC-pumpe og en komprimert hydrogentank koblet til strømnings hydrogeneringsanordningen gjennom ledninger utstyrt med tilbakeslagsventiler for å hindre tilbakestrømning. Produktet skyves av HPLC-pumpen og blandes med hydrogen i en T-formet blander. Denne blandingen ledes deretter gjennom en liten patron inneholdende 10% Pd / C katalysator på en fast bærer. Etter å ha passert gjennom cataLyst det reduserte produktet blir deretter samlet i små fraksjoner.
Etter hydrogenering blir det råprodukt transportert og injisert manuelt i HPLC for rensing av sluttproduktet ( Figur 5 ). Den mobile fase av HPLC er blitt valgt for å være kompatibel med dyrinjeksjon. Toppene som tilsvarer produktet blir deretter samlet og filtrert sterilisert for å oppnå sluttdosen.
Før dosering av PET-bildestudier utføres, utføres kvalitetskontrolltester. Disse testene utføres for å sikre at sporen er den kjemiske enheten som den skal være og at den er trygt til injeksjon. Noen av disse testene kan ikke kreves for injeksjon i dyr, men det anbefales vanligvis å følge retningslinjene for bruk av mennesker. Å gjøre det, sikrer produktets kvalitet, noe som øker tilliten til resultatene og stor gradIliterer fremtidig overgang til produksjon av produktet til human injeksjon.
Tabell 1 inneholder de typiske synteseparametere, inkludert startmengde radioaktivitet, innledende mengde forløper, utbytte for hvert trinn, spesifikk aktivitet, filtrering mister osv. Disse parametrene er nyttige feilsøking sporadiske feil og fremtidig optimalisering av prosedyren.
Figur 1. Reaksjonsskjema. Radiokjemisk syntese består av merking av 19 F / 18 F utveksling etterfulgt av palladiumkatalysert hydrogenering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" />
Figur 2. Hydrogeneringssystem. Skjematisk for enheten. Denne enheten er basert på utgivelsen av Yoswathananont et al. (Ref 13).
Figur 3. Skjema for syntetisator integrert fluidprosessor (IFP) og reagenser. IFP inneholder fire reagenshetteglass, en QMA patron og en reaktorhetteglass. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. UV- og radioHPLC-sporstoffer for mellomprodukt. 3-fluor-4-nitropyridin-N-oksid har en karakteristisk absorpsjon ved 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. UV- og radioHPLC-sporere for sluttprodukt. 3-fluor-4-aminopyridin absorberes ved en 254 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Konsept | Mean (n = 4) | SD | kommentarer |
| Første 18 F aktivitet (mCi) | 148,0 | 44,9 | Start av syntese |
| Forløper mengde (μg) | 50 | Bruk 50 μl 1,0 mg / ml lager | |
| Aktivitet igjen i QMA (mCi) | 3.0 | 1.7 | Målt på slutten av merkingstrinnet |
| Radiolabeling utbytte | 29,7% | 6,3% | Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) |
| Radiokjemisk renhet (HPLC-1) | > 98% | Fra HPLC-1 QC | |
| Spec. handling. Mellomprodukt (mCi / μmol) | 122,9 | 29.7 | Fra HPLC-1 ved bruk av kalibreringskurve |
| Hydrogeneringsgjenvinning (dc) | 74% | 9,0% | Korrigert for forfall |
| HPLC-radiokjemisk renhet (HPLC-2) | 90,7% | 2,9% | Beregnet fra HPLC-2 |
| Tørkeffektivitet | > 98% | Korrigert for forfall | |
| Filtrering av gjenoppretting | 93,5% | 1,7% | Korrigert for forfall |
| Dosevolum (mL) | 3.3 | Samle fraksjoner med høyest radioaktivitet | |
| Spec. handling. Sluttprodukt (mCi / μmol) | 75.5 | 30.0 | Fra HPLC-3 ved hjelp av kalibreringskurve |
| Synteseffektivitet | 8,5% | 3,6% | Ikke-forfall korrigert |
| Syntese tid (min) | 104 | 11.2 |
Tabell 1. Radiochemiske synteseparametere.
| Vanlige problemer | Potensielle grunner og løsninger |
| [ 18 F] fluorid blir ikke effektivt eluert fra QMA | · TBA-HCO 3 ble ikke forberedt på riktig måte. Sørg for at konsentrasjonen er tilstrekkelig. |
| · Det er lekkasjer på TBA-HCO 3 hetteglasset. Pass på at krympetetningen er stram og septum ikke gjennomboret før du installerer den på IFP. | |
| · TBA-HCO 3 er ikke i god stand. Bestil en ny batch. | |
| Etikettutbyttet er lavt | · Det er fuktighet i forløperoppløsningen. Tørr forløper og løsningsmidler. |
| · Temperaturen er for lav. | |
| Reaksjonsløsning er gul | · Produktet dekomponerer på grunn av base. Bruk mindre TBA-HCO 3 . |
| · Det er tSå mye forløper. Bruk mindre forløper. | |
| · Det er for lite løsningsmiddel for mengden 18 F - . Bruk mer løsningsmiddel. | |
| Ekstra topper på radioHPLC | · Nitrogruppen blir erstattet: redusere reaksjonstemperaturen eller forkorte reaksjonstiden. |
| Hydrogeneringsreaksjonen virker ikke | · Katalysatoren er ikke bra. Bruk en ny patron. |
| · Strømmen er for rask og tillater ikke tilstrekkelig kontakt mellom katalysator og substrat. Reduser strømmen. | |
| · Hydrogentrykk er for lavt. Øk H 2 -trykket. | |
| Hydrogentrykk øker dramatisk under prosedyre | · Kassettintegritet er kompromittert, og solid støtte støter på linjene. Stopp strømmen og slå av gassen. La radioaktivitet forfall. Fjern katalysatorpatronen og spyl systemet. Sett enEw patron. |
| Hydrogeneringsutbyttet er lavt | · For mange urenheter som konkurrerer om katalysatoren (MeCN, oksalsyre). Reduser mengden av urenheter eller øk massen av forløperen (Advarsel: økende forløper mengde vil redusere spesifikk aktivitet). |
| Utvinning av radioaktivitet fra hydrogeneringstrinn er lav | · Det er en lekkasje i systemet. Kontroller at det er lekkasje og tilbakeslag i hydrogenledningen. |
| · Forbindelse er defluorinerende i reaktoren. Vurdere ulike reaksjonsbetingelser (trykk, temperatur, strømning, etc. ). | |
| For mye radioaktivitet går tapt under filtrering | · Våt filteret før bruk. |
| · Bruk filter med lavere dødvolum. | |
| Endelig produkt topp på HPLC ser bredt ut | · For mye volum injisert. Injiser lavere amount. Bruk kolonne med større diameter. |
| · Kolonnen er ikke godt kondisjonert. Tilstand kolonnen for minst 30 kolonnevolumer. | |
| · Den mobile fasenes pH er lav. Kontroller at pH ≥ 8. | |
| · Kolonnen er ikke i god stand. Erstatt kolonne. Bruk kolonne som er kompatibel med grunnleggende pH. |
Tabell 2. Feilsøkingsveiledning.
Discussion
Utarbeidelsen av PET-tracere krever effektiv merking med minimal brukerintervensjon for å minimere strålingseksponering 14 . Her beskrev vi den første halvautomatiserte prosedyren for den radiokjemiske syntesen av [ 18 F] 3F4AP, en PET-sporingsenhet som for tiden er undersøkt for avbildning av demyelinering. Denne semi-automatiserte metoden produserer radiotracer med høy renhet og tilstrekkelig spesifikk aktivitet for dyreforsøk. Tidligere metoder for syntesen av denne forbindelsen baserte seg på manuell syntese 6 , som signifikant begrenser mengden av radioaktive sporstoffer som kan fremstilles. Å ha en automatisert metode for syntesen gir også mer reproduserbare utbytter og gjør det lettere å overføre prosedyren til andre laboratorier med lignende utstyr. Fremtidige anstrengelser for å fullføre automatiseringen av prosedyren vil være medvirkende til produksjonen av sporen i høye mengder for studier hos store dyr eller mennesker.
19 F for 18 F for å innlemme radioisotopen i molekylet av interesse. Fordelene ved denne reaksjon er at den er rask og produserer nesten utelukkende det ønskede produkt uten behov for å utføre et potensielt langt rensingstrinn for å fjerne overflødig forløper. En begrensning ved bruk av fluor-utvekslingsmærkningsreaksjoner som den som benyttes her, er at på grunn av innledende masse av kald forbindelse kan den endelige spesifikke aktivitet definert som mengde av radioaktivitet i mCi over mengden av forbindelse i μmol være begrenset. Under standardbetingelsene, startende med 100-200 mCi på 18 F og 50 μg forløper, er den typiske spesifikke aktiviteten ved synteseenden opptil 100-200 mCi / μmol, som ser ut til å være tilstrekkelig for prekliniske PET-bildestudier . Likevel kan den spesifikke aktiviteten bli bedre ved å øke utgangsmengden for 18 F - 15 , 16 .
Som med alle radiokjemiske synteseer av PET-sporstoffer, er det viktig å arbeide raskt for å minimere radioaktivt henfall. Det er også viktig å minimere tiden som håndterer de radioaktive materialene, bruke riktig skjerming og maksimere avstanden mellom det radioaktive materialet og brukeren for å minimere strålingseksponering. Disse aspektene er spesielt viktige i løpet av andre halvdel av protokollen (rensing og kvalitetskontroll) der brukeren må injisere løsningen manuelt i HPLC, samle fraksjonene og filtrere sluttproduktet.
Som med alle radiokjemiske synteseer av PET-sporstoffer, er det viktig å jobbe raskt for å mInimize radioaktivt henfall. Det er også viktig å minimere tiden som håndterer de radioaktive materialene, bruke riktig skjerming og maksimere avstanden mellom det radioaktive materialet og brukeren for å minimere strålingseksponering. Disse aspektene er spesielt viktige i løpet av andre halvdel av protokollen (hydrogenering og rensing) der brukeren må injisere løsningen manuelt i hydrogenatoren, samle fraksjonene, sette opp tørkeprosedyren, gjenoppløse produktet i buffer og filtrere det. Under filtreringstrinnet er det lett å miste mye radioaktivt materiale i hetteglassets vegger. Derfor er det viktig å prøve å samle all væske før filtering. Bruk av en større mengde buffer for å oppløse kan forbedre utbyttet av utvinning, men bruken av dette blir motvirket fordi det vil kreve injisering av et større volum på HPLC, noe som får toppen til å utvide og øke volumet av sluttdosen.
For å feilsøke aÅ optimalisere prosedyren er viktig for å holde oversikt over avkastningen til hvert trinn. For de fleste trinn gjøres dette bare ved å måle mengden radioaktivitet før og etter hvert trinn. Ved reaksjonen kan utbyttet beregnes ved kvantifisering av HPLC-toppene. Tabell 1 i resultateksjonen viser de typiske utbyttene for hvert trinn. Tabell 2 nedenfor viser mange av de vanligste feilene med potensielle årsaker til feilen og hvordan du kan rette dem.
Til slutt, selv om prosedyren vist her er spesifikk for syntesen av [18F] 3F4AP, er den generelle arbeidsflyten og mange av de enkelte trinnene felles for syntesen av andre forbindelser 17 . I denne artikkelen demonstrerte vi også de typiske QC-tester som ble utført på en hvilken som helst PET-tracer.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd NIH / NIBIB 1K99EB020075 til Pedro Brugarolas og en Innovasjonsfondspris fra Chicago Innovation Exchange til Brian Popko og Pedro Brugarolas. Prof. Brian Popko er takknemlig anerkjent for hans mentorskap og økonomisk støtte til prosjektet. Prof. Chin-Tu Chen og Integrated Small Animal Imaging Research Resource ved University of Chicago er anerkjent for sjenerøst å dele laboratorierom og utstyr. IBA er anerkjent for sponsring av åpen tilgang til denne artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclotron produced [18F]fluoride | House supplied/Zevacor | IBA Cyclone 18 | 100-200 mCi |
| Integrated fluid processor for production FLT/FDG | ABX | K-2715SYN | Cassette used for nucleophilic substitution |
| Anhydrous acetonitrile | Janssen | 36431-0010 | Transfer under nitrogen |
| Methanol | Janssen | 67-56-1 | |
| ultrapure water | house supplied | Millipore MilliQ system | |
| TBA-HCO3 | ABX | 808.0000.6 | abx.de |
| QMA | Waters | WAT023525 | Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water |
| Sodium bicarbonate | ABX | K-28XX.03 | Prefilled 5 mL syringes |
| Alumina-N | Waters | WAT020510 | Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-) |
| 3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide | Synthonix | 76954-0 | Store in desicator. Precursor |
| 3-fluoro-4-aminopyridine | Sigma Aldrich | 704490-1G | Reference standard |
| Oxalic acid | Sigma Aldrich | 75688-50G | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S80191-1 | |
| Triethyl amine | Fisher Scientific | 04885-1 | |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | USP |
| Final product vial | ABX | K28XX.04 | |
| Millex Filter Syringe | Millex | SLGVR04NL | |
| 10% Pd/C cartridge | Sigma Aldrich | THS-01111-12EA | |
| 11 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 03-250-618, 06-451-117, or equivalent | |
| 13 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 06-718-992, 06-718-643, or equivalent | |
| HPLC vials | Fisher Scientific | 03-391-16, 03-391-17, or equivalent | |
| SEMIPREP C18 column | Agilent | 990967-202 | |
| V-vials | Alltech | ||
| Syringes: 1, 3, 10 mL | Fisher Scientific | 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent | |
| Compressed gases: N2, He, H2 | Airgas | UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent | |
| TLC plates | Sigma Aldrich | Z193275, or equivalent | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synthera automated synthesizer | IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com | Synthera, 250.001 | Automatic synthesis unit |
| In-house hydrogenator | See picture | See text description | |
| Hot cells | Comecer | For manipulating radioactive materials | |
| RadioTLC scanner | Eckert and Ziegler | For handling sterile materials | |
| HPLC | Dionex | Ultimate 3000 | |
| Dose calibrator | Capintec | CRC15 | Or equivalent |
| Gamma counter | Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 | CRC 15, PET-CRC25, or equivalent | For measuring radioactivity |
| Personal dosimeters | Packard | Cobra II | For measuring gamma spectrum |
| Personal radiation badges and rings | Atlantic Nuclear | Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent | |
| Rotavap + vacuum pump | Landauer | ||
| Lead pigs + syringe shields | Heidolph | Or equivalent | |
| Geiger counter | Pinestar | ||
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent |
References
- Valk, P. E. Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , Springer. (2003).
- Phelps, M. E. PET: molecular imaging and its biological applications. , Springer. (2004).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A.
- Oriuchi, N., et al. Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).
- Heiss, W. D., Herholz, K.
- Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -H., DeJesus, O. Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides. Chemical Communications. , (2016).
- Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
- Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).
- Goodman, A. D., et al. Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial. Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).
- Brugarolas, P., et al. Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , Amer Chemical Soc. (2016).
- Brugarolas, P., et al. Development of a PET tracer for MS. J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).
- Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, Suppl 3. 493 (2015).
- Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C. Chem Comm. (1), 40-42 (2005).
- Stöcklin, G., Pike, V. W. Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, Springer Science & Business Media. (1993).
- Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
- Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
- Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , Wiley. (2012).
![Automatisert radiokjemisk syntese av [<sup> 18</sup> F] 3F4AP: En ny PET-tracer for bildebehandling av demyeliniserende sykdommer](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/55537.jpg)
