Single Molecule Analyse af Laser Lokaliserede Psoralen Adducts

Summary

Lasere anvendes ofte i studier af det cellulære respons på DNA beskadigelse. Men de generere læsioner, hvis afstand, hyppighed, og kollisioner med replikationsgafler sjældent karakteriseret. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der muliggør bestemmelse af disse parametre med laser lokaliseret interstrengstværbindinger.

Abstract

DNA Damage Response (DDR) er blevet grundigt karakteriseret i undersøgelser af dobbeltstrengsbrud (DSB'er) induceret af laser micro bestrålingen i levende celler. DDR til helix fordreje covalente DNA modifikationer, herunder interstrengs DNA tværbindinger (ICLS), er ikke så veldefinerede. Vi har undersøgt DDR stimuleret af ICLS, lokaliseret ved hjælp af laser fotoaktivering af immunotagged psoralener, i kerner af levende celler. For at løse fundamentale spørgsmål om addukt distribution og replikationsgaffel møder, vi kombineret laser lokalisering med to andre teknologier. DNA fibre ofte bruges til at vise forløbet af replikationsforgreninger ved immunfluorescens af nukleosidanaloger inkorporeret under korte impulser. Immunoquantum prikker er ofte blevet anvendt til enkelt molekyle billeddannelse. I den nye fremgangsmåde er DNA fibre fra celler, der bærer laser lokaliserede ICLS spredes på mikroskopobjektglas. De mærkede ICLS vises med immunoquantum prikker og the inter-læsion afstande bestemt. Replikationsgaffel sammenstød med ICLS kan visualiseres og forskellige støder mønstre identificeres og kvantificeres.

Introduction

DNA er under konstant angreb fra eksogene midler såsom stråling, ultraviolet lys, miljømæssige toksiner, forbrændingsprodukter, etc. Endvidere er det også angrebet af endogene radikaler produceret af oxidativ metabolisme. Alle disse har potentiale til kemisk eller fysisk forstyrre integriteten af DNA ^1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA Damage Response (DDR), en rekruttering og posttranslationel modifikation kaskade med hundredvis, hvis ikke tusinder, af proteiner og microRNA involveret i læsion reparation, regulering af cellecyklussen, apoptose, fremadskridende alderdom og inflammatoriske pathways ^2.

De fleste af vores information om DDR, kommer fra studier med DSBs. Dette er i vid udstrækning på grund af tilgængeligheden af teknologier til indføring pauser, herunder sekvensspecifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler ^3. Desuden propensity af pauser til at inducere foci af DDR-proteiner, som kan vises ved hjælp af immunfluorescens, har været meget nyttigt til identifikation af kinetikken og krav i responderende proteiner. En af de vigtigste teknologier til at studere DDR blev introduceret af Bonner og kolleger, der brugte en laserstråle til at lede en stribe af DSBs i en "Region of Interest" (ROI) i kerner af levende celler ^4. I realiteten skabte de en langvarig fokus, hvor proteiner af DDR kunne identificeres ved immunfluorescens. Dette blev illustreret ved deres demonstration af stærk stribe af phosphoryleret histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerede celler. Siden da har laser fremgangsmåde været anvendt i talrige undersøgelser af DDR induceret af DSB'er. Selvom kraftfulde og populære, og kilden til dramatiske immunofluorescens billeder, skal det bemærkes, at laseren intensitet i de fleste forsøg er justeret således at producere observerbare resultater, uden bekymring for læsion identitet,densitet, eller indbyrdes afstand. Faktisk kan det være vanskeligt at foretage disse skøn. De er således stort set ignoreret, trods de mange læsioner indført i DNA ved lasere ^5. Dette bidrager til de mange modsætninger i litteraturen ^6.

I modsætning til DSBs, de fleste kemiske modifikationer af DNA ikke stimulere dannelsen af ​​diskrete foci af DDR-proteiner. Dette er vigtigt i lyset af vores nuværende forståelse af læsion frekvenser. Det er blevet anslået, at humane celler i kultur pådrage så mange som 50 DSB'er per celle cyklus, der dannes i høj grad under S-fasen ^{7, 8, 9.} Færre dannes i ikke-prolifererende celler. Dette står i modsætning til antallet af nucleobase tab eller modifikation begivenheder, som i titusindvis per celle / dag ^{1, 10.} Således ved vi mest omDDR fremkaldt af begivenheder, der er relativt sjældne, og meget mindre om dem fremkaldt af helix forvridende læsioner, som tilsammen er langt mere almindelige.

For at afhjælpe spørgsmål om det cellulære respons på kovalente modifikationer af genomisk DNA, vi ønskede at arbejde med en helix fordreje DNA addukt, havde iboende DDR induktionsaktivitet. Desuden for at lette eksperimentelle design og fortolkning vi var interesserede i en struktur, hvis introduktion kan kontrolleres med hensyn til tid og var modtagelig for visualisering. Derfor udviklede vi en strategi baseret på psoralen. Psoralener er velkarakteriserede fotoaktive DNA-interkalatorer favoriserer 5'TA: AT sites. I modsætning til andre tværbindingsmidler såsom nitrogensennepper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA reaktive medmindre udsat for langbølget UV (UVA) lys. De indskudte molekyler reagerer med thyminbaser på modsatte strenge at producere helix fordreje interstrengstværbindinger (ICLS) ^11. Med trimethyl psoralen anvendt i vores eksperimenter fleste produkter er ICLS, relativt få monoadducts genereres (mindre end 10%) ¹² og intrastreng tværbindinger mellem tilstødende baser på én streng er ikke dannet. Fordi de er stærke blokke til replikation og transkription, psoralen og andre tværbindingsmidler, ligesom cis-platin og MMC, er almindeligt anvendt i kemoterapi. Således psoralen aktiveret undersøgelser, der fulgte aktiveringen af ​​DDR ved en helix fordreje struktur, og også leveret indsigt i den cellulære reaktion til en forbindelse med klinisk betydning.

Syntetiserede vi et reagens, hvori trimethyl psoralen var knyttet til digoxigenin (DIG), en plantesterol ikke findes i pattedyrceller og anvendes hyppigt som et immunotag. Kravet om fotoaktivering tillader lokalisering af laserlys (365 nm) af psoralen ICLS i definerede ROI i kerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mod Dig tag. DNA-reparation og DDR-proteinerne syntes i striberne af laser lokaliserede ICLS ^{13, 14.}

DDR aktiveres ved de høje laser intensiteter anvendes til fremstilling af DSB'er kunne skyldes isoleret eller grupperet skade ^{15, 16.} Følgelig til relevansen af ​​resultater fra disse forsøg naturligt forekommende læsioner, til stede i meget lavere koncentration, er usikker. For at løse lignende spørgsmål om psoralen addukt frekvens og afstand i DNA, tog vi fordel af DNA fiberteknologi ¹⁷ og immunoquantum prikker. Kvantepunkter er meget lysere end fluorescerende farvestoffer og er ikke bleget af udsættelse for lys. De er således ofte til enkelt molekyle billeddannelse ^18, en ansøgning, som fluorescerende farvestoffer er tilstrækkeligt lyse. Individuelle DNA fibre kan strækkes på glass rutschebaner og kan vises ved immunofluorescens mod nukleosidanaloger inkorporeret under inkubationer før cellehøst. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og udsat ROI for laser micro bestråling. Fibre blev fremstillet fra cellerne og individuelle Dig-psoralen addukter kunne visualiseres med immunoquantum prikker. Udsættelse af cellerne for nukleosidanaloger for relativt korte tidsrum (20-60 min) tillader visningen af ​​replikations skrifter i nærheden af ​​laser lokaliseret ICLS.

Protocol

1. Fremstilling af Dig-TMP Bland 50 mg (0,18 mmol) 4'-chlormethyl-4,5' , 8-trimethylpsoralen og 590 mg (2,7 mmol) af 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i en tør 25 ml runde Bunden kolbe under nitrogen. Tilsættes 10 ml toluen og tilbagesvaling i 12 timer. Fjernelse af opløsningsmiddel i en rotationsfordamper under reduceret tryk. Remanensen renses ved flashsøjlekromatografi over silicagel. Søjlen elueres med chloroform, methanol og 28% ammoniakopløsning (9: 1: 0,5). Opl…

Representative Results

Laser lokaliserede Dig-TMP (figur 1A) ICLS kan vises ved immunofluorescens mod Dig-mærket knyttet til psoralen. Selvom laseren kan rettes til at slå i et område af enhver kontur, striber er ikke "naturlige" former i celler, og legitime signaler kan let skelnes fra artefakter på grund af ikke-specifik binding med primære eller sekundære antistoffer. Denne funktion er nyttig, når du bruger antistoffer af mindre end perfekt specificitet. Et eksempel på den…

Discussion

Laseren lokalisering teknologi kræver anvendelse af adhærerende celler med kerner, der er synlige i lysfeltmikroskopi. Vi har forsøgt at vedhæfte vedhæftede celler, såsom primære lymfocytter eller løst adhærerende dyrkede celler, såsom AD293, til glasoverfladen med celleadhæsive præparater, såsom polylysin eller kollagen, eller mere komplekse blandinger. Selv om disse behandlinger kan binde cellerne til overfladen, finder vi, at de generelt forblive afrundet gør det meget vanskeligt at fokusere ind i kerne…

Materials

Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100ml	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107