واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts
Summary
وكثيرا ما تستخدم أشعة الليزر في دراسات الاستجابة الخلوية للتلف الحمض النووي. ومع ذلك، فإنها تولد الآفات التي تباعد، والتردد، والتصادم مع تكرار الشوك نادرا ما تتسم. هنا، نحن تصف النهج الذي تمكن من تحديد هذه المعايير مع الليزر المترجمة crosslinks interstrand.
Abstract
الاستجابة DNA الأضرار (DDR) تميزت على نطاق واسع في دراسات فواصل حبلا مزدوجة (DSBs) الناجمة عن الليزر الجزئي شعاع الإشعاع في الخلايا الحية. وDDR إلى الحلزون تشويه التعديلات DNA التساهمية، بما في ذلك crosslinks DNA interstrand (ICLS)، لم يتم تعريف أيضا. لقد درسنا DDR يحفزه ICLS، مترجمة من قبل تنشيط ضوئي ليزر psoralens immunotagged، في نوى الخلايا الحية. من أجل معالجة المسائل الأساسية حول توزيع ناتج إضافة واللقاءات تكرار مفترق الطرق، ونحن الجمع بين التعريب الليزر مع اثنين من التقنيات الأخرى. وغالبا ما تستخدم الألياف DNA لعرض التقدم من تكرار الشوك المناعي من نظائرها نيكليوزيد أدرجت خلال نبضات قصيرة. وقد استخدمت على نطاق واسع النقاط Immunoquantum للتصوير جزيء واحد. في النهج الجديد، وتنتشر الألياف DNA من خلايا تحمل ICLS الليزر المحلية على الشرائح المجهر. يتم عرض ICLS الموسومة مع نقاط immunoquantum والعشرينالبريد المسافات بين الآفة تحدد. اصطدام شوكة النسخ المتماثل مع ICLS يمكن تصور وتحديد أنماط مختلفة لقاء وquantitated.
Introduction
الحمض النووي هو تتعرض لهجوم مستمر من وكلاء خارجي مثل الإشعاع، والأشعة فوق البنفسجية، والسموم البيئية، ونواتج الاحتراق، الخ بالإضافة إلى ذلك، تعرضت لهجوم من قبل أيضا الأنواع المتطرفة الذاتية التي تنتجها عملية الأيض التأكسدي. كل هذه لديها القدرة على تعطيل كيميائيا أو فيزيائيا على سلامة DNA 1. الاضطرابات في الجينوم يمكن تنشيط الاستجابة DNA الأضرار (DDR)، والتوظيف وآخر متعدية سلسلة تعديل مع مئات، إن لم يكن الآلاف، من البروتينات وmicroRNAs المشاركة في إصلاح الآفة، وتنظيم دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، الشيخوخة، ومسارات للالتهابات 2.
معظم المعلومات التي لدينا حول DDR يأتي من الدراسات مع DSBs. هذا هو في جزء كبير نظرا لتوافر تكنولوجيات لإدخال فواصل، بما في ذلك فواصل محددة تسلسل، في الحمض النووي الجيني في الخلايا الحية 3. بالإضافة إلى ذلك، propensitذ فواصل للحث على بؤر البروتينات DDR، والتي يمكن أن يتحلى بها المناعي، كانت مفيدة جدا لتحديد حركية ومتطلبات البروتينات الاستجابة. وقدم واحدة من التكنولوجيات الرئيسية لدراسة DDR التي كتبها بونر والزملاء، الذين استخدموا شعاع ليزر لتوجيه شريط من DSBs في "منطقة الاهتمام" (ROI) في نوى الخلايا الحية 4. في الواقع، وأنشأوا التركيز مطول التي يمكن من خلالها تحديد البروتينات من DDR المناعي. وقد تجلى ذلك من خلال مظاهرتهم من شريط قوي من H2AX هيستون فسفرته (γ-H2AX) في الخلايا الليزر عرضة للخطر. منذ ذلك الحين، تم توظيف النهج الليزر في العديد من الدراسات من DDR الناجمة عن DSBs. وعلى الرغم من قوة وشعبية، ومصدر الصور المناعي مثيرة، وتجدر الإشارة إلى أنه في معظم التجارب يتم ضبط كثافة الليزر وذلك لتحقيق نتائج ملحوظة، من دون قلق للهوية الآفة،الكثافة، أو تباعد. في الواقع، يمكن أن يكون من الصعب وضع هذه التقديرات. وبالتالي فإنها يتم تجاهل إلى حد كبير، على الرغم من تعدد الإصابات التي أدخلت الحمض النووي عن طريق الليزر 5. هذا يساهم في العديد من التناقضات في الأدب 6.
وعلى النقيض من DSBs، معظم التعديلات الكيميائية من DNA لا تحفز تشكيل بؤر منفصلة من البروتينات DDR. وهذا أمر مهم في ضوء فهمنا الحالي للترددات الآفة. وتشير التقديرات إلى أن خلايا الإنسان في الثقافة تتحمل ما يصل الى 50 DSBs في دورة الخلية، شكلت إلى حد كبير خلال المرحلة S 7 و 8 و 9. وتشكل أقل في الخلايا غير المتكاثرة. وهذا يتناقض مع عدد من الخسائر nucleobase أو الأحداث التعديل، والتي هي في عشرات الآلاف في كل خلية / يوم 1 و 10. وهكذا، ونحن نعرف أكثر عنوDDR الناجمة عن الأحداث التي هي نادرة نسبيا، وأقل بكثير عن تلك الناجمة عن الحلزون تشويه الآفات، والتي في مجموعها هي أكثر شيوعا بكثير.
ومن أجل التصدي لأسئلة حول الاستجابة الخلوية لالتساهمية التعديلات من الحمض النووي الجيني، أردنا أن نعمل مع الحلزون تشويه ناتج إضافة DNA الذي كان ملازم النشاط DDR الاستقراء. وعلاوة على ذلك، لتسهيل التصميم التجريبي والتفسير نحن مهتمون في هيكل التي يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق الوقت، وكانت قابلة للتصور المقدمة. وفقا لذلك، وضعنا إستراتيجية تعتمد على السورالين. Psoralens تتميز أيضا intercalators DNA متفاعل صالح 5 "TA: AT المواقع. على عكس وكلاء يشابك الأخرى مثل الخردل النيتروجين وميتوميسين C (MMC) أنهم ليسوا الحمض النووي رد الفعل ما لم تتعرض لموجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية (UVA) الضوء. جزيئات مقحم تتفاعل مع قواعد الثايمين على مسارات معاكسة لإنتاج الحلزون تشويه crosslinks interstrand (ICLS) 11. مع السورالين ثلاثي المستخدمة في تجاربنا معظم المنتجات ICLS، يتم إنشاء عدد قليل monoadducts نسبيا (أقل من 10٪) 12، وcrosslinks intrastrand بين القواعد المجاورة على واحدة حبلا لا تتشكل. لأنهم كتل قوية لتكرار والنسخ، السورالين وغيرها من العوامل يشابك، مثل رابطة الدول المستقلة البلاتين وMMC، وتستخدم عادة في العلاج الكيميائي. وبالتالي تمكين السورالين الدراسات التي أعقبت تفعيل DDR من قبل الحلزون تشويه هيكل، وقدم أيضا نظرة ثاقبة على الاستجابة الخلوية للمجمع مع أهمية سريرية.
نحن توليفها كاشف الذي ارتبط السورالين ثلاثي لdigoxigenin (حفر)، وستيرول النبات لا توجد في خلايا الثدييات، وكثيرا ما تستخدم باعتبارها immunotag. شرط لتنشيط ضوئي يسمح التعريب بواسطة ضوء الليزر (365 نانومتر) من ICLS السورالين في العائد على الاستثمار المحددة في نوى في الخلايا الحية. هذه يمكن عرضها من قبل IMMunofluorescence ضد العلامة حفر. إصلاح الحمض النووي والبروتينات DDR ظهرت في خطوط الليزر المترجمة ICLS 13 و 14.
وDDR تفعيلها من خلال كثافة الليزر العالية المستخدمة لإنتاج DSBs يمكن أن يكون راجعا إلى معزولة أو تتجمع الضرر 15 و 16. وبالتالي، فإن أهمية نتائج هذه التجارب لتحدث بشكل طبيعي الآفات والحاضر تركيز على أقل من ذلك بكثير، غير مؤكد. لمعالجة مسائل مماثلة حول تردد ناتج إضافة السورالين والتباعد في الحمض النووي، وإننا قد استفادت من تكنولوجيا الألياف DNA 17 والنقاط immunoquantum. النقاط الكمومية هي أكثر إشراقا بكثير من الأصباغ الفلورية ولا المبيض عن التعرض للضوء. وهكذا في كثير من الأحيان يتم استخدامها للتصوير جزيء واحد 18، وهو التطبيق الذي الأصباغ الفلورية مشرقة بما فيه الكفاية. الألياف DNA الفردية يمكن أن تمتد على زالشرائح معشوقة ويمكن عرضها من قبل المناعي ضد نظائرها نيكليوزيد أدرجت خلال حضانات قبل الخلية الحصاد. كنا نعامل والخلايا مع حفر-السورالين وتعرض عائد الاستثمار لأشعة الليزر الدقيقة. أعدت ألياف من الخلايا وadducts-حفر السورالين الفردية يمكن تصوره مع النقاط immunoquantum. تعريض الخلايا لنيكليوزيد نظائرها لأوقات قصيرة نسبيا (20-60 دقيقة) يسمح عرض مساحات النسخ المتماثل في محيط ICLS الليزر المترجمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتطلب تكنولوجيا الليزر توطين استخدام الخلايا الملتصقة مع نوى التي تظهر في المجهر مشرق الميدان. حاولنا أن نعلق خلايا غير ملتصق، مثل الخلايا الليمفاوية الأولية، أو الخلايا المستزرعة ملتصقة فضفاضة مثل AD293، على سطح الزجاج مع الاستعدادات خلية لاصقة مثل متعدد الليزين أو …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث في جزء من برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للشيخوخة (Z01 AG000746-08) وصندوق أبحاث فقر دم فانكوني.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O’Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage – when is a DSB not a DSB?. Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
