Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии
Summary
Липидные капли являются важными органеллы для репликации нескольких патогенных микроорганизмов, в том числе вируса гепатита С (HCV). Мы опишем метод, чтобы изолировать липидные капли для количественного масс-спектрометрии ассоциированных белков; он может быть использован при различных условиях, например, вирусной инфекции, экологический стресс, или лекарственной терапии.
Abstract
Липидные капельки имеют важное значение для репликации множества различных патогенов, наиболее заметно вирусом гепатита С (HCV), как предполагаемый сайт вириона морфогенеза. Количественный анализ протеых липидов капель может быть использован для идентификации белков, которые локализуют или смещены из липидных капель в условиях, такие как вирусные инфекции. Здесь мы опишем протокол, который был успешно использован для характеристики изменений в протеоме липидных капельного следующие инфекций HCV. Мы используем стабильные изотопы Этикетировочные с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) и, таким образом маркировать полную протеые одной популяции клеток с «тяжелыми» аминокислотами для количественного определения белков с помощью масс-спектрометрии. Для выделения липидов капли, две клеточных популяций (то есть HCV-инфицированные / «легкая» аминокислота и неинфицированная контрольная / «тяжелая» аминокислота) смешивает 1: 1 и лизируют механически гипотонический буфер. После удаления ядер и клеток Debris низкоскоростного центрифугирования, липидные капли белки, ассоциированные обогащены два последующих стадий ультрацентрифугирования с последующих тремя стадиями промывки в изотоническом буфере. Чистота фракций капель липидов анализируют с помощью вестерн-блоттинга с антителами, распознающих различные субклеточные отсеки. Липидные капельные-ассоциированные белки затем разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием Кумасси. После расщепления трипсина, пептиды количественно с помощью жидкостной хроматографии-ионизации электрораспыления-тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-МС / МС). С помощью этого метода, мы идентифицировали белки набраны в липидных капель при инфекции HCV, которые могут представлять про- или противовирусных факторов хозяина. Наш метод может быть применен к различным различных клеток и условий культивирования, таких как инфекции с патогенами, экологический стресс, или лекарственной терапии.
Introduction
Липидные капли имеют высокие динамические цитоплазматические (и ядерные) органеллы клеток , состоящие из сердцевины нейтральных липидов (триглицериды (ТГ) и холестерин эфир (С)) приложен монослоем фосфолипидов со встроенными белками 1. Все типы клеток производят липидные капли, но они различаются по размеру, составу липидов и белков украшения. Липидные капли выполняют различные функции, в том числе, выступающие в качестве энергии и предшественников мембраны резервуаров или в виде белковых отложений. Кроме того, через поглощение липидов, они защищают клетки от Липотоксичности, липиды высвобождения в качестве сигнальных молекул, и участвуют в деградации белков и эндоплазматический ретикулум (ЭР) реакции на стрессе 2. Таким образом, множество белков связываются с липидных капель и регулируют их генерации, деградацию, торговлю, и взаимодействие с другими органелл. Среди них perilipin семейство добросовестных связывающих белков липидной капельки (PLIN1-5)е "> 3.
Липидный капли биогенез вероятно , начинается в ER, где ER-резидентов ферменты катализируют синтез нейтральных липидов , которые накапливаются внутри мембранного бислоя, образуя линзу нейтральных липидов, процесс , который недавно был визуализирован красиво в дрожжах 4. Мембрана изгиба и повышенные уровни фосфатидной кислоты и диацилглицерина затем думали , чтобы привлечь белки , участвующие в биосинтезе фосфолипидов, как одновременное синтеза основных нейтральных липидов и фосфолипидов экранирующих требуются для выработки липидов капели 5. Ферменты, несущие трансмембранные домены, которые находятся в ER катализирует этот процесс. Экспансия крупных липидных капель требует активности другого класса липидов синтеза ферментов, которые укрывают амфипатическую спираль и таким образом перемещаются из ЭР в липидных капель. Мобилизации липидов из липидных капель происходит за счет локальной активации triglyceridе и диацилглицерин липаза жировая ткань триглицерид липаза (ATGL) и гормон-чувствительная липаза (HSL) или различными пути аутофагии, такие как макро- и microlipophagy или шаперон-опосредованная аутофагия 6. Липидные капли взаимодействуют с другими клеточными органеллами, такие как митохондрии (для беты-окисления и синтеза липидов) и ER (для синтеза липидов и торговли белком), но и с лизосомами, эндосыми и вакуолей , вызванной внутриклеточными бактериями 7. Действительно бактерии, вирусы, паразиты и даже предназначаться липидные капли для репликации и упорства, среди них 8 HCV.
ВГС – инфекция является одной из ведущих причин печени , связанные с заболеваемостью и смертности во всем мире, что составляет около 0,5 миллиона смертей в год 9. Истинное число инфекций HCV неизвестно, но недавние оценки показывают, что 130 – 150 миллионов людей хронически инфицированы. Нет vaccinе существует, но недавно утвержденное прямое действие противовирусных значительно увеличить терапевтические реакции по сравнению со стандартной терапией интерферона основой. Тем не менее, во всем мире, лечение больных, вероятно, будет ограничено из-за чрезвычайно высокой стоимости новых терапевтических средств. Около половины всех лиц, хронически инфицированный вирусом гепатита С развитием жировой болезни печени (стеатоз), состояние, характеризующееся избыточным накоплением липидных капель в гепатоцит. Интересно, что липидные капли также становится жизненно важные клеточные органеллы для репликации HCV, предполагаемо , выступающей в качестве вирусных сборочных участков 10, 11.
В HCV-инфицированных клетках, вирусный белок ядра и NS5A локализуются в липидных капель в процессе , который зависит от биосинтеза триглицеридов, в качестве ингибиторов диацилглицерол ацилтрансферазы-1 (DGAT1) ухудшать оборотом в липидных капель и последующего производства HCV 12 частиц </sup>, 13, 14, 15. Кроме того, мутации в липидных капельных-связывающих доменов либо ядра или NS5A подавить сборку HCV 16, 17. Сердечник и NS5A затем набирать все другие вирусные белки, а также комплексы репликации вирусной РНК, с мембранами , тесно связанных с липидом капель 16. Согласованные действия всех вирусных белков требуются для успешного производства инфекционного вирусного потомства 10, 11. Структурные белки являются частью вирионов, и неструктурные белки способствуют белок-белковых взаимодействий, необходимых для этого процесса. Интересно, что добросовестные липидный капелька-связывающий белок PLIN3 / TIP47 необходим как для HCV репликации РНК и высвобождение вирионов 18, 19 <suр>, 20. Несмотря на эти последние достижения, механистические детали, особенно на вирус-хозяин взаимодействий в поздних стадиях репликации вируса гепатита C, по-прежнему плохо определены, и точная функция липидных капель неизвестна.
Здесь мы описываем способ, чтобы изолировать липидные капли для количественного масс-спектрометрии ассоциированных белков. С помощью этого метода, мы обнаружили глубокие изменения в протеоме липидов капели во время инфекции HCV и определил аннексин A3 в качестве хоста – белка , который со-фракционирование с липидным капель и требуется для созревания эффективности HCV 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол для выделения липидных капель для количественного анализа липидов капель протеома, чтобы сравнить обогащение и истощение белков, ассоциированных с каплями липидов при различных условиях культивирования, таких как вирусные инфекции. В качестве альтернативно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Р. Bartenschlager (Университет Гейдельберга) для конструкций Jc1, CM Райс (Rockefeller University) для клеток Huh7.5, J Мак-Лошлен (Medical Research Council вирусологии Unit) для JFH1 строительства, T Уэйкита (Национальный институт Инфекционные заболевания, Япония) для JFH1 и B Уэбстер и Ук Грин (Гладстон Институт вирусологии и иммунологии) для репортер конструкций HCVcc. Эта работа была поддержана за счет средств от DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, и INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Pette Институт Heinrich, Лейбниц Институт экспериментальной вирусологии поддерживается Вольного и Ганзейского города Гамбурга и Федеральным министерством здравоохранения. В спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide – filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3′ untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3’UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
