Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas
Summary
gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.
Abstract
gotitas de lípidos son vitales para la replicación de una variedad de diferentes agentes patógenos, lo más prominente el virus de la hepatitis C (HCV), como el sitio putativo de la morfogénesis del virión. el análisis del proteoma gotas de lípidos cuantitativa se puede utilizar para identificar las proteínas que se localizan en o desplazadas de gotitas de lípidos bajo condiciones tales como las infecciones de virus. A continuación, se describe un protocolo que ha sido utilizado con éxito para caracterizar los cambios en el proteoma gotas de lípidos después de la infección por el VHC. Utilizamos isótopos estables Etiquetado con Aminoácidos en cultivo celular (SILAC) y por lo tanto etiquetar el proteoma completo de una población de células con aminoácidos "pesados" para cuantificar las proteínas por espectrometría de masas. Para el aislamiento de gotitas de lípidos, las dos poblaciones de células (es decir, aminoácidos infectados por el VHC / "luz" y ácidos no infectadas de control / "pesados" amino) se mezclan 1: 1 y se lisaron mecánicamente en tampón hipotónico. Después de retirar los núcleos y células debris por centrifugación a baja velocidad, las proteínas de gotitas asociada a lípidos se enriquecen mediante dos etapas de ultracentrifugación posteriores seguido de tres etapas de lavado en tampón isotónico. La pureza de las fracciones de gotas de lípidos se analizó por transferencia de Western con anticuerpos que reconocen diferentes compartimentos subcelulares. proteínas de gotitas asociada a lípidos se separan luego mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido de tinción con Coomassie. Después de digestión tríptica, los péptidos se cuantifican mediante espectrometría de masas de cromatografía de ionización por electrospray en tándem líquido (LC-ESI-MS / MS). Usando este método, se identificaron proteínas reclutados a gotitas de lípidos tras la infección HCV que podrían representar factores del huésped pro- o antivirales. Nuestro método se puede aplicar a una variedad de diferentes células y condiciones de cultivo, tales como la infección con patógenos, estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.
Introduction
Gotitas de lípidos son altamente orgánulos celulares citoplasmáticos (y nucleares) dinámicas compuestas de un núcleo de lípidos neutros (triglicéridos (TG) y de éster de colesterol (CE)) cerrado por una monocapa de fosfolípidos con proteínas incrustadas 1. Todos los tipos de células producen gotitas de lípidos, pero que varían en tamaño, composición lipídica, y la decoración de la proteína. gotitas de lípidos cumplen diversas funciones, incluyendo servir como depósitos de energía y precursores de membrana o como depósitos de proteínas. Además, a través de la absorción de lípidos, que protegen las células de la lipotoxicidad, lípidos de liberación como moléculas de señalización, y están involucrados en la degradación de proteínas y las respuestas al estrés de retículo endoplásmico (ER) 2. Como tal, una gran cantidad de proteínas se unen a las gotas de lípidos y gobernar su generación, la degradación, la trata, y la interacción con otros organelos. Entre ellos se encuentran la familia de proteínas de unión perilipina gotas de lípidos de buena fe (PLIN1-5)f "> 3.
Lipid gotita biogénesis probable comienza en el ER, donde las enzimas ER-residente catalizan la síntesis de lípidos neutros que se acumulan dentro de la bicapa de la membrana, formando una lente de lípidos neutros, un proceso que recientemente se visualizó muy bien en la levadura 4. Membrana de flexión y los niveles elevados de ácido y diacilglicerol fosfatídicos son entonces pensaron para atraer a las proteínas implicadas en la biosíntesis de fosfolípidos, como la síntesis simultánea de los lípidos neutros de núcleo y los fosfolípidos de blindaje que se requiere para la generación de gotas de lípidos 5. Las enzimas que albergan dominios transmembrana que residen en el ER catalizan este proceso. Expansión a grandes gotas de lípidos requiere la actividad de una clase diferente de enzimas lípidos sintetizar que albergan una hélice anfipática y por lo tanto puede viajar desde el ER a gotitas de lípidos. La movilización de lípidos de gotitas de lípidos se produce a través de la activación local del triglicéridoE y diacilglicerol lipasa lipasas adiposo triglicéridos (ATGL) y lipasa sensible a hormonas (HSL) o por diferentes vías autofágicas, tales como macro- y microlipophagy o autofagia 6 chaperona-mediadas. Gotitas de lípidos interactúan con otros orgánulos celulares, tales como las mitocondrias (por beta-oxidación y la síntesis de lípidos) y ER (para la síntesis de lípidos y el tráfico de proteínas), pero también con los lisosomas, endosomas, y las vacuolas inducidos por bacterias intracelulares 7. De hecho bacterias, virus, e incluso parásitos diana gotitas de lípidos para la replicación y la persistencia, entre ellos HCV 8.
Infección por el VHC es una de las principales causas de morbilidad relacionada con el hígado y mortalidad en todo el mundo, lo que representa aproximadamente 0,5 millones de muertes al año 9. El número real de infecciones por VHC es desconocida, pero las estimaciones recientes sugieren que 130 – 150 millones de personas están infectadas crónicamente. sin vaccine existe, pero los antivirales de acción directa-aprobados recientemente aumentar de forma espectacular las respuestas terapéuticas en comparación con la terapia estándar con interferón. Sin embargo, en todo el mundo, el tratamiento de los pacientes probablemente será restringido debido a los costos extremadamente altos de las nuevas terapias. Alrededor de la mitad de todos los individuos infectados crónicamente con VHC desarrollan enfermedad de hígado graso (esteatosis), una condición caracterizada por la acumulación excesiva de gotitas de lípidos en los hepatocitos. Curiosamente, gotitas de lípidos también surgieron orgánulos celulares como vitales para la replicación del VHC, que sirve putativamente como sitios de ensamblaje viral 10, 11.
En las células infectadas con el VHC, el núcleo de la proteína viral y NS5A localizar a gotitas de lípidos en un proceso que depende de la biosíntesis de triglicéridos, como inhibidores de la diacilglicerol aciltransferasa-1 (DGAT1) poner en peligro el tráfico a gotas de lípidos y producción de partículas posterior HCV 12 </sup>, 13, 14, 15. Además, las mutaciones en los dominios de unión de gotitas de lípidos de cualquiera de núcleo o NS5A suprimen ensamblaje del VHC 16, 17. Core y NS5A reclutan entonces todas las otras proteínas virales, así como los complejos de replicación de ARN viral, a las membranas estrechamente asociados con lípidos gotitas 16. Se requiere una acción concertada de todas las proteínas virales para la producción exitosa de la progenie viral infecciosa 10, 11. Las proteínas estructurales son parte de los viriones, y las proteínas no estructurales promueven las interacciones proteína-proteína necesarios para este proceso. Curiosamente, se requiere la bona fide la unión a lípidos gotita-PLIN3 proteína / TIP47 tanto para la replicación del ARN del VHC y la liberación de viriones de 18, 19 <sup> 20. A pesar de estos avances recientes, los detalles mecanísticos, especialmente de las interacciones virus-huésped durante las últimas etapas de la replicación del VHC, permanecen mal definido, y la función precisa de las gotitas de lípidos es desconocida.
A continuación, describimos un método para aislar las gotitas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas. Usando este método, hemos encontrado cambios profundos en el proteoma gotas de lípidos durante la infección por VHC y identificado anexina A3 como una proteína de acogida que la co-fracciona con gotitas de lípidos y es necesario para la maduración HCV eficiente 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se describe un protocolo para aislar gotitas de lípidos para el análisis de gotas de lípidos proteoma cuantitativo para comparar el enriquecimiento y agotamiento de proteínas asociadas con gotitas de lípidos bajo diversas condiciones de cultivo, tales como infecciones virales. Como un método alternativo, el análisis del proteoma se puede realizar con cuantificaciones libre de etiqueta basado en intensidades total de los picos. Este método no tiene ninguna limitación de la gama dinámica y evita problemas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a R. Bartenschlager (Universidad de Heidelberg) para las construcciones JC1, CM Arroz (Universidad de Rockefeller) para las células Huh7.5, J. McLauchlan (Unidad de Virología del Medical Research Council) para la construcción, T. Wakita (Instituto Nacional de JFH1 Enfermedades Infecciosas, Japón) para la JFH1, y B. Webster y WC Greene (Instituto Gladstone de Virología e Inmunología) para las construcciones de reportero HCVcc. Este trabajo fue apoyado por fondos de la DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, y INST 337 / 16-1 2013 (HS)). El Instituto Heinrich Pette, Instituto Leibniz de Virología Experimental es apoyado por la Ciudad Libre y Hanseática de Hamburgo y el Ministerio Federal de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
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