脂滴隔离定量质谱分析
Summary
脂滴是几种病原体，包括丙型肝炎病毒（HCV）复制重要的细胞器。我们描述分离为相关蛋白的定量质谱脂滴的方法;它可以在各种条件下，如病毒感染，环境压力，或药物治疗中使用。
Abstract
脂滴是多种不同的病原体，最突出的是丙型肝炎病毒（HCV）复制至关重要的，因为病毒粒子的形态发生的推定站点。定量脂滴的蛋白质组分析可以用于鉴定定位于或诸如病毒感染的条件下从脂滴移位蛋白质。在这里，我们描述了已经成功用于表征以下感染HCV的脂滴蛋白质组变化的协议。我们在细胞培养（SILAC）使用稳定同位素标记与氨基酸和因此标签与“重”氨基酸细胞的一个群体的完整蛋白质通过质谱定量的蛋白质。对于脂滴隔离，这两个细胞群体（ 即 HCV感染/“光”的氨基酸和未感染的对照/“重”氨基酸）的1：1混合并在低渗缓冲液进行机械裂解。除去细胞核和细胞天后通过低速离心ebris，脂滴相关蛋白通过随后在等渗缓冲液洗涤3次两个后续步骤超速离心富集。脂滴级分的纯度通过Western印迹用抗体识别不同的亚细胞区室分析。脂滴相关蛋白然后通过随后进行考马斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。胰蛋白酶消化后，将肽通过液相色谱 – 电喷雾离子化串联质谱（LC-ESI-MS / MS）进行定量。使用这种方法，我们发现招募到在HCV感染的脂滴可能代表亲或抗病毒宿主因子的蛋白质。我们的方法可以适用于各种不同的细胞和培养条件，如感染病原体，环境压力，或药物治疗。
Introduction
脂滴高度的中性脂质的核心组成的动态细胞质（和核）细胞器（甘油三酯（TG）和胆固醇酯（CE））通过磷脂单层具有嵌入蛋白1包围。所有类型的细胞产生的脂滴，但它们在大小，脂质组成，和蛋白质装饰变化。脂滴满足不同的功能，包括作为能量和膜前体贮存器或作为蛋白质沉积物。此外，通过脂类的摄取，它们防止脂毒性细胞，释放脂质作为信号分子，并参与蛋白质的降解和内质网（ER）应激2响应。因此，蛋白质的宿主结合脂滴和管理其生成，降解，贩卖，和相互作用与其他细胞器。其中有善意的脂滴结合蛋白的围脂滴蛋白家族（PLIN1-5）F“> 3。
脂滴的生物合成可能开始于ER，其中ER驻留酶催化膜双层内累积中性脂质的合成，从而形成中性脂质的透镜，这是最近在酵母4很好地可视化的方法。膜弯曲和升高的磷脂酸和二酰基甘油水平，然后认为吸引涉及磷脂生物合成的蛋白质，作为核心中性脂质和屏蔽磷脂的同时合成所需的脂质液滴产生5。驻留在ER酶窝藏跨膜结构域催化了这个过程。膨胀到大的脂滴需要不同类窝藏一个两亲性螺旋，因此可以从ER到脂滴行进脂质合成酶的活性。从脂滴脂质动员发生通过甘油三酯的局部活化e和甘油二酯的脂肪酶脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）或由不同的自噬途径，如宏观和microlipophagy或分子伴侣介导的自噬6。脂滴与其他细胞器，诸如线粒体（用于β-氧化和脂质合成）和ER相互作用（对于脂质合成和蛋白质运输），而且还与溶酶体，核内体，并且通过细胞内细菌7诱导的空泡。事实上细菌，病毒，甚至寄生虫目标，其中8 HCV复制和持久性脂滴。
HCV感染是全世界肝病相关的发病率和死亡率的主要原因之一，占每年9约为0.5万人死亡。 HCV感染的真正数量是未知的，但最近的估计表明，130 – 150万人受到慢性感染。没有疫苗免疫Ë存在，但相比于标准的基于干扰素治疗最近批准的直接作用的抗病毒药显着提高治疗反应。然而，在世界范围内，患者的治疗很可能会因新疗法的成本非常高的限制。大约有一半的人的慢性HCV感染者发展脂肪肝（脂肪变性），其特点是脂滴在肝细胞中堆积过多的条件。有趣的是，脂滴也出现了HCV复制的重要细胞器，推定作为病毒组装站点10，11。
在HCV感染的细胞，病毒蛋白核心和NS5A定位于以依赖于甘油三酯生物合成的过程脂滴，如二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1）的抑制剂削弱贩卖脂滴和随后的HCV颗粒生产12 </sup>，13，14，15。此外，在任一核心或NS5A的脂滴结合结构域的突变抑制HCV装配16，17上 。芯和NS5A再招所有其它病毒蛋白，以及病毒RNA复制复合物，与脂质相关的密切滴16的膜。需要成功地生产感染性病毒子代10，11的所有病毒蛋白质的一致行动。结构蛋白是病毒体的一部分，和非结构蛋白促进这个过程所需要的蛋白质 – 蛋白质相互作用。有趣的是，需要对善意脂滴结合蛋白PLIN3 / TIP47两种HCV RNA的复制和病毒颗粒18的释放，19 <suP>，20。尽管有这些最新进展，该机制的细节，尤其是在HCV复制的后期病毒与宿主相互作用，依然不明确，而脂滴的确切功能未知。
在这里，我们描述了以分离的脂滴为相关蛋白的定量质谱法的方法。使用这种方法，我们发现在脂滴蛋白组HCV感染期间和深刻的变化确定膜联蛋白A3为共同分馏与脂滴，并需要有效HCV成熟21的宿主蛋白。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了一种协议来隔离脂滴定量脂滴的蛋白质组分析来比较具有不同的培养条件，如病毒感染下脂滴相关的蛋白质的富集和耗尽。作为一种替代的方法，所述蛋白质组分析可以与基于总的峰强度的无标记的量化来执行。这个方法没有动态范围的限制，避免了代谢问题。的SILAC方法的优点是，将样品汇集之前脂滴隔离，因此，结果是独立的错误在样品制备，消化，和LC-MS / MS分析。我们?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢R. Bartenschlager（海德堡大学）的JC1结构，CM赖斯（洛克菲勒大学）的Huh7.5细胞，J·麦克劳奇伦（医学研究理事会病毒学单元）为JFH1建造，T·韦克塔（国家研究所传染病，日本）的JFH1，和B·韦伯斯特和克·格林（病毒学研究所格莱斯顿和免疫学）为HCVcc的记者结构。这项工作是由从DFG资金支持（HE 6889 / 2-1（EH），INST 337 / 15-1 2013，和INST 337 / 16-1 2013（HS））。海因里希Pette研究所，莱布尼兹研究所实验病毒学由自由汉萨城汉堡和健康的联邦支持。该资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿没有作用。
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
- Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
- Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
- Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).
- Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
- Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide – filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
- Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
- Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
- Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
- Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
- Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
- Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
- Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
- Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
- Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
- Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
- Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
- Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
- Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
- Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3′ untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
- Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
- Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3’UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).
