Isolation Lipid Droplet pour l'analyse quantitative de spectrométrie de masse
Summary
des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.
Abstract
Les gouttelettes lipidiques sont essentielles à la réplication d'une variété de différents agents pathogènes, le plus en évidence le virus de l'hépatite C (VHC), comme le site présumé de virion morphogenèse. analyse des gouttelettes de lipide protéome quantitative peut être utilisée pour identifier les protéines qui se localisent à ou sont déplacés à partir de gouttelettes lipidiques dans des conditions telles que les infections virales. Nous décrivons ici un protocole qui a été utilisé avec succès pour caractériser les changements dans le protéome des gouttelettes de lipides après infection par le VHC. Nous utilisons l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) et l'étiquette ainsi le protéome complet d'une population de cellules avec des acides « lourds » acides pour quantifier les protéines par spectrométrie de masse. Pour l' isolation des gouttelettes de lipides, les deux populations de cellules ( par exemple le VHC infectés / acides aminés « légers » et témoins non infectés / acides aminés « lourds ») sont mélangés à 1: 1 et lysées mécaniquement dans un tampon hypotonique. Après avoir enlevé les noyaux et cellules debris par centrifugation à basse vitesse, les protéines de gouttelettes lipidiques associée sont enrichies par deux étapes d'ultracentrifugation ultérieures suivies de trois étapes de lavage dans un tampon isotonique. La pureté des fractions de gouttelettes lipidiques est analysé par transfert de type western avec des anticorps reconnaissant les différents compartiments subcellulaires. protéines associées à des gouttelettes lipidiques sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. Après digestion trypsique, les peptides sont quantifiés par spectrométrie de masse Chromatographie liquide-électrospray-tandem à ionisation (LC-ESI-MS / MS). En utilisant cette méthode, nous avons identifié des protéines recrutées à des gouttelettes lipidiques sur l'infection par le VHC qui pourraient représenter des facteurs d'accueil pro- ou anti-viraux. Notre méthode peut être appliquée à une variété de différentes cellules et conditions de culture, telles que l'infection par des agents pathogènes, stress environnemental ou un traitement médicamenteux.
Introduction
Les gouttelettes lipidiques sont des organelles cellulaires hautement cytoplasmiques (et nucléaires) dynamique composé d'un noyau de lipides neutres (triglycérides (TG) et l' ester de cholestérol (CE)) entourée par une monocouche de phospholipides avec des protéines intégrées 1. Tous les types de cellules produisent des gouttelettes lipidiques, mais ils varient en taille, la composition des lipides, et la décoration des protéines. Les gouttelettes lipidiques remplissent diverses fonctions, notamment comme réservoirs d'énergie et d'un précurseur de membrane ou en tant que dépôts de protéines. De plus, grâce à l'absorption des lipides, ils protègent les cellules de lipotoxicité, les lipides de libération sous forme de molécules de signalisation, et sont impliqués dans la dégradation des protéines et réticulum endoplasmique (RE) les réponses au stress 2. En tant que tel, une multitude de protéines se lient à des gouttelettes lipidiques et régissent leur génération, la dégradation, la traite, et l'interaction avec d'autres organelles. Parmi ceux – ci sont la famille périlipine des protéines de liaison des gouttelettes de lipides de bonne foi (PLIN1-5)f "> 3.
Gouttelette lipidique biogenèse commence probablement à l'ER, où les enzymes ER-résident catalysent la synthèse des lipides neutres qui accumulent dans la membrane bicouche, la formation d' une lentille de lipides neutres, un procédé qui a été récemment visualisé bien dans la levure 4. Membrane de flexion et des taux élevés d'acides phosphatidiques et de diacylglycérol sont alors pensé à attirer des protéines impliquées dans la biosynthèse des phospholipides, comme la synthèse simultanée des lipides neutres de base et les phospholipides de blindage est nécessaire pour la génération de gouttelettes de lipides 5. Enzymes hébergeant des domaines transmembranaires qui se trouvent à l'ER catalysent ce processus. Extension de grosses gouttelettes de lipides nécessite l'activité d'une autre classe d'enzymes de synthèse de lipides qui abritent une hélice amphipathique et peut ainsi se déplacer à partir de l'ER à des gouttelettes lipidiques. La mobilisation des lipides de gouttelettes lipidiques se produit par l'activation locale du triglycéridee lipase et diacylglycérol triglycéride lipases adipeux (ATGL) et de la lipase sensible aux hormones (HSL) ou par différentes voies de autophagiques, tels que autophagie macro- et microlipophagy ou chaperon à médiation 6. Les gouttelettes lipidiques interagissent avec d' autres organelles cellulaires tels que mitochondries (pour la bêta-oxydation et la synthèse des lipides) et ER (pour la synthèse des lipides et le trafic de protéine), mais aussi avec les lysosomes, les endosomes et les vacuoles induites par des bactéries intracellulaires 7. En effet les bactéries, les virus, les parasites et même cible gouttelettes lipidiques pour la réplication et la persistance, parmi eux le VHC 8.
L' infection par le VHC est l' une des principales causes de la morbidité liée au foie et mortalité dans le monde, ce qui représente environ 0,5 million de décès par an 9. Le nombre réel d'infections par le VHC est inconnu, mais les estimations récentes suggèrent que 130 – 150 millions de personnes sont chroniquement infectées. pas VACCINe existe, mais l'augmentation a récemment approuvé Antiviraux-à action directe de façon spectaculaire les réponses thérapeutiques par rapport à la thérapie à base d'interféron standard. Cependant, dans le monde entier, le traitement des patients sera probablement limitée en raison des coûts extrêmement élevés des nouveaux traitements. Environ la moitié des personnes chroniquement infectées par le VHC développent une maladie du foie gras (stéatose), une condition caractérisée par l'accumulation excessive de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. Intrigant, des gouttelettes lipidiques ont également émergé comme organites cellulaires vitaux pour la réplication du VHC, au service putative comme sites d'assemblage viraux 10, 11.
Dans les cellules infectées par le VHC, le noyau de la protéine virale et NS5A localisent à des gouttelettes de lipides dans un processus qui dépend de la biosynthèse des triglycérides, en tant qu'inhibiteurs de la diacylglycérol acyltransférase 1 (DGAT1) compromettre le trafic de gouttelettes lipidiques et la production de particules de VHC subséquente 12 </sup>, 13, 14, 15. En outre, des mutations dans les domaines de gouttelettes lipidiques de liaison de l' une ou noyau NS5A du VHC suppriment l' assemblage 16, 17. Core NS5A recrutent alors toutes les autres protéines virales, ainsi que des complexes de réplication d'ARN viral, des membranes étroitement associées à des gouttelettes lipidiques 16. Une action concertée de toutes les protéines virales est nécessaire pour la production réussie de la descendance virale infectieuse 10, 11. Les protéines structurelles font partie des virions, et les protéines non structurales favorisent les interactions protéine-protéine nécessaire à ce processus. Curieusement, la protéine de liaison aux lipides gouttelettes de bonne foi PLIN3 / TIP47 est nécessaire à la fois pour la replication de l' ARN du VHC et la libération des virions 18, 19 <sup>, 20. En dépit de ces progrès récents, les détails mécanistiques, en particulier des interactions virus-hôte au cours des dernières étapes de la réplication du VHC, restent mal définis, et la fonction précise des gouttelettes lipidiques est inconnue.
Nous décrivons ici une méthode pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées. En utilisant cette méthode, nous avons trouvé des changements profonds dans le protéome des gouttelettes de lipides lors de l' infection par le VHC et l' annexine A3 identifié comme une protéine hôte qui co-fractionne avec des gouttelettes lipidiques et est nécessaire pour la maturation du VHC efficace 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour isoler des gouttelettes lipidiques pour l'analyse du protéome des gouttelettes de lipides quantitative pour comparer l'enrichissement et l'appauvrissement des protéines associées à des gouttelettes lipidiques dans des conditions de culture diverses, telles que les infections virales. En tant que méthode alternative, l'analyse du protéome peut être réalisée avec quantifications sans étiquette basée sur l'intensité totale des pics. Cette méthode n'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions R. Bartenschlager (Université de Heidelberg) pour les constructions jc1, CM Riz (Université Rockefeller) pour les cellules Huh7.5, J. McLauchlan (Conseil de recherches médicales Virologie) pour la construction JFH1, T. Wakita (Institut national de la Maladies infectieuses, Japon) pour le JFH1, et B. Webster et WC Greene (Gladstone Institute of Virology and Immunology) pour les constructions rapporteurs HCVcc. Ce travail a été financé par des fonds de la DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 et INST 337 / 16-1 2013 (SH)). L'Institut Heinrich Pette, Institut Leibniz pour Experimental Virology est pris en charge par la Ville libre et hanséatique de Hambourg et le ministère fédéral de la santé. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
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