지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
지질 방울은 비리의 형태 형성의 추정되는 사이트로, 다른 병원균의 다양한 가장 눈에 띄게 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 복제에 중요합니다. 양적 지질 방울 프로테옴 분석에 지역화 또는 바이러스 감염과 같은 조건에서 지질 방울에서 변위 단백질을 식별 할 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 HCV 감염 다음과 같은 지질 방울 프로테옴의 변화를 특징 짓는 데 사용 된 프로토콜을 설명합니다. 우리는 세포 배양 (SILAC)에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨 사용하여 질량 분석에 의해 단백질을 정량하는 "무거운"아미노산 셀 중 하나 명 인구의 전체 프로테옴 레이블을 붙입니다. 도 1 및 저장성 완충액에 용해 기계적 : 지질 방울 분리를위한 두 개의 세포 집단 (즉, HCV 감염 / "광"아미노산 및 비감염 제어 / "무거운"아미노산 1) 혼합한다. 핵 및 세포 D를 제거한 후저속 원심 분리에 의해 ebris은 지질 방울 - 관련 단백질은 등장 완충액 세 세척 단계 다음에 두 단계 이후의 초 원심 분리에 의해 농축된다. 지질 방울 분획의 순도는 상이한 세포 내 구획을 인식하는 항체로 웨스턴 블 롯팅하여 분석한다. 지질 방울 - 관련 단백질 후 쿠마시 염색 하였다 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리된다. 트립신 소화 후에, 펩티드는 액체 크로마토 그래피 - 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS / MS)에 의해 정량화된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 프로 또는 바이러스 호스트 요소를 나타낼 수 HCV 감염시 지질 방울에 모집 단백질을 확인했다. 우리의 방법은 병원체 감염, 환경 스트레스, 약물 치료와 같은 다른 세포 및 배양 조건의 종류에 적용될 수있다.
서론
지질 방울 높은 중성 지질 코어 이루어지는 동적 세포질 (핵) 세포 소기관이다 (중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)) 임베디드 단백질 1 인지질 단층에 의해 둘러싸인. 모든 종류의 세포는 지질 방울을 생산하지만, 크기, 지질 성분, 단백질 장식 다양합니다. 지질 소적 에너지와 막 전구체 저수지 또는 단백질 침착 물로서 작용 등 다양한 기능을 수행. 또한, 지질의 흡수를 통해, 그들은 신호 분자로서 세포에서 리포 독성 (lipotoxicity), 박리 보호 지질 및 단백질 분해하고 소포체 (ER) 스트레스 반응에 관여하는 2. 따라서, 단백질의 호스트 지질 방울에 결합하여 다른 세포 소기관과 함께 자신의 생성, 파괴, 인신 매매, 및 상호 작용을 제어합니다. 그 중 (PLIN1-5) 선의의 지질 방울 결합 단백질의 perilipin 가족F "> 3.
지질 생합성 액적 가능성 중성 지질 렌즈 최근 효모 4 좋게 가시화하는 처리를 형성 ER 상주 효소 막 이중층 내에 축적 중성 지질 합성을 촉매 소포체에서 시작한다. 굽힘 막과 높은 포스 폰산 및 디아 실 글리세롤의 수준은 다....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
세포 배양에서 아미노산으로 안정 동위 원소 표지 (SILAC) 용 매체 1의 제조
주 : 여기에서, SILAC 단백질 정량 키트 - DMEM이 SILAC 표지에 사용 된 13 C 6 아르기닌 L 염산 50 mg의 보충. 투석 된 소 태아 혈청 (FCS)을 SILAC 단백질 정량 키트가 제공된다.
- DMEM 배지에서 각각 50 ㎖ 병을 제거하고 투석 된 FCS 50 mL를 첨가.
- 13 C 6 L 라이신 2HCl 50 mg의 배지 1 ㎖의 13 C 6 L 염산 아르기닌 50mg을 녹인다. 철저하게 혼합하고, DMEM + FCS 매체에 아미노산을 추가합니다.
- 1X 펜 / 연쇄상 구균 및 1X L 글루타민 대체를 추가합니다. 멸균 필터 0.45 μm의 필터를 사용하여 기록 매체. "무거운"SILAC 매체로 병 레이블.
- L- 아르기닌 염산 50 mg의 L- 라이신 2HCl-50를 사용하여 1.3 mg의 -은 "광"배지를 제조하기 위해 반복 단계 1.1. "같은 병 레이블광 "SILAC 매체.
2. SIL....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
지질 방울 비리 어셈블리의 추정 사이트와 같은 HCV 감염에 매우 중요하지만, 형태 형성과 비리의 출구의 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 이 과정에 관여하는 신규 한 호스트 종속 요소를 식별하기 위해 HCV에 감염된 세포를 21 (도 1a)의 양적 지질 방울 프로테옴 분석을 수행 하였다. 우리는 지질 소적의 정제를위한 프로토콜을 확립하고 일상적 지질 방울 결합 단백질 PLIN2 / ADRP 및 PLIN3 / TIP47과 미토콘드리아 용 마이크로 튜브에 대한 이러한 β-tubulin의 다른 세포 구획 마커의 고갈 MnSOD 강한 농축 검출 또는 ER (도 1B, C)에 대한 칼레 티 큘린 / calnexin. 우리는 동위 원소 라벨을 사용하여, 특별히 모집 확인 된 단백질을 안정적으로 Huh7.5 세포 (그림 1D)와 지질 방.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기서, 우리는 바이러스 감염 등 다양한 배양 조건에서 지질 소적과 연관된 단백질의 농축 및 고갈 비교 정량 지질 방울 프로테옴 분석 지질 방울을 분리하는 프로토콜을 기술한다. 다른 방법으로, 프로테옴 분석 전체 피크 강도에 기초하여 라벨없는 정량화하여 수행 될 수있다. 이 메소드는 동적 범위 제한이 없으며 대사 문제를 피할 수있다. SILAC 접근법의 장점은 샘플 전에 지질 방울 분리를 풀링하고, 따라서 결과가 다이제스트, 샘플 준비의 오류와 무관하고, LC-MS / MS 분석이다. 우리는 매우 정량적 지질 방울 프로테옴 분석을 위해이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
유도 또는 단백질의 발현을 억제, quantitativ 의해 발현 수준의 분석을 반영 할 수있는 보충 또는 MS 분석에서 관찰 지질 방울 - 관련 단백질의 고갈로E 및 RT-PCR (바람직) 웨스턴 블 롯팅을 의뢰한다. 웨스턴 블 롯팅 및 BODIPY 또는 LD540, 기재 (2.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리의 JFH1 구성, T. 와키 타 (국립 연구소의 JC1 구조에 대한 R. 문헌 [Bartenschlager (하이델베르크 대학)의 Huh7.5 세포에 대한 CM 라이스 (록펠러 대학교), J 맥로치랜 (의학 연구위원회 (Medical Research Council) 바이러스학 단위) 감사합니다 HCVcc 리포터 작 제물에 대한 감염증의 JFH1 일본) 및 B. 웹스터 WC 및 그린 (바이러스학 글래드스턴 연구소 면역학). 이 작업은 DFG 자금 지원 하였다 (HE 6889 / 2-1 (EH), 337 / 15-1 2,013 INST 및 이달 337 / 16-1 2,013 (HS)). 하인리히 Pette 연구소, 실험 바이러스학에 대한 라이프니츠 연구소는 자유와 한자 동맹의 도시인 함부르크와 건강의 연방 교육부에 의해 지원됩니다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SILAC 단백질 정량 분석 키트 - DMEM | Thermo Fisher | 89983 | |
| 13C6 L-아르기닌-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 | |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 | |
| Roti-Blue 5x 집중 | Roth GmbH | A152.2 | |
| 10x SDS-트리스-글리신 - 완충기 | Geyer Th. GmbH & 주식회사 KG | A1415,0250 | |
| 글루타맥스 (100x) | 라이프 테크놀로지스 | 350500038 | |
| 세포 배양을 위한 페니실린/스트렙토마이신 솔루션 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml | |
| DPBS 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 | |
| 트립신-EDTA | 시그마-알드리치 케미 GmbH | T3924-100ML | |
| 염화나트륨 BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 | |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A | |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 5 mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML | |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 | |
| 염산(HCl) 37% 순수 Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 | |
| DC 단백질 분석 | 바이오-라드 콜라보라토리스 GmbH | 500-0116 | |
| 글리세롤 | AppliChem GmbH | 151339 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 | |
| 브로모페놀 블루 | AppliChem GmbH | A2331 | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 | |
| 블라스티시딘 | 인비보젠 | ant-bl-1 | |
| 염화칼륨 | AppliChem GmbH | A1039 | |
| 페닐메탄설포닐 플루오라이드 | AppliChem GmbH | A0999 | |
| 인산칼륨 일염기 | 성 시그마-Aldrich Chemie GmbH | ||
| 수소인산이칼륨 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 | |
| 디티 | AppliChem GmbH | A2948 | |
| NP-40 | AppliChem | A1694 | |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 | |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 | |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 | |
| M6PRB1/TIP47 100 &마이크로; g | abcam | ab47639 | |
| 칼레티큘린, pAb 200 &마이크로; g | 엔조 생명 과학 GmbH | ADI-SPA-600-F | |
| 안티-&베타;-Tubulin | 시그마-알드리치 케미 GmbH | T6074 200&마이크로; 엘 | |
| 에탄올 앱솔루트 (EtOH) | Geyer Th. GmbH & 주식회사 KG | A3678,0250 | |
| 안티 MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F | |
| 안티-마우스 HRP | 써모 피셔 피어스 | 32430 | |
| 안티-래빗 HRP | 써모 피셔 Pierce | 32460 | |
| Amersham 하이퍼필름 ECL | GE 헬스케어 | 28906836 | |
| Lumi-Light 웨스턴 블로팅 기판 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | ||
| 96웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-One GmbH | 655 180쪽; | |
| 테루모 주사기 1 mL | 테루모 | SS-01T | |
| 필트로푸르 BT 50, 500 mL, 0.45 &마이크로; 엠 | 사르스테트 | 83.1823.100 | |
| Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔, 모든 kD 분해능 젤 | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-One GmbH | 657160 | |
| 접시 Nunclon 150/20 | 피셔 사이언티픽 GmbH | 10098720 - 168381 | |
| 셀 스크레이퍼 | neoLab Migge GmbH | C-8120 | |
| 튜브, 50 mL | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| SafeSeal 튜브 RNase-free | 사르스테트 | 72.706.400 | |
| 울트라 클리어 원심분리기 튜브 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 | |
| 흡입 바늘 | Transcodent | 6482 | |
| Biosphere Fil. 팁 1000 | 사르스테트 | 70.762.211 | |
| 생물권 Fil. 팁 200 | SARSTEDT | 70.760.211 | |
| 생물권 Fil. 팁 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 | |
| Dounce 티슈 그라인더 | Fisher Scientific GmbH | ||
| Dounce All-Glass 티슈 그라인더용 11883722 유봉 | Fisher Scientific GmbH | ||
| Orbitrap Fusion | |||
| Branson Sonifier 450 | |||
| Thermomixer 편안함, Thermoblock 1.5 mL | Eppendorf | 5355 000.127 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot 모듈 및 PowerPac 기본 전원 공급 장치, | BioRad | 165-8033 | |
| Mini-PROTEAN 3 멀티캐스팅 챔버 | BioRad | 165-4110 | |
| PowerPac HC 전원 공급 장치 | Biorad | 164-5052 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424R | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424 | |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 | |
| SW 60 Ti 로터 | Beckman Coulter GmbH | ||
| 인피니트 M1000 프로 | 테칸 |
참고문헌
- Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Brasaemle, D. L.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
