लिपिड बूंदों हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) सहित कई रोगाणुओं की प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण अंगों कर रहे हैं। हम संबद्ध प्रोटीन की मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लिपिड बूंदों को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन; यह इस तरह के वायरस के संक्रमण, पर्यावरण के तनाव, या नशीली दवाओं के उपचार के रूप में की स्थिति, की एक किस्म के तहत इस्तेमाल किया जा सकता।
लिपिड बूंदों विरिअन morphogenesis के ख्यात साइट के रूप में, विभिन्न रोगजनकों की एक किस्म है, सबसे प्रमुखता से हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) की प्रतिकृति के लिए महत्वपूर्ण हैं। मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण प्रोटीन हैं जो करने के लिए स्थानीय बनाना या इस तरह के वायरस के संक्रमण के रूप में शर्तों के तहत लिपिड बूंदों से विस्थापित कर रहे हैं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक एचसीवी के साथ संक्रमण के बाद लिपिड छोटी बूंद proteome में परिवर्तन चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया वर्णन करते हैं। हम सेल संस्कृति (SILAC) में एमिनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करें और इस प्रकार मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन quantitate करने के लिए "भारी" अमीनो एसिड के साथ कोशिकाओं में से एक की आबादी का पूरा proteome लेबल। लिपिड छोटी बूंद अलगाव के लिए, दो सेल आबादी (यानी एचसीवी से संक्रमित / "प्रकाश" अमीनो एसिड और असंक्रमित नियंत्रण / "भारी" अमीनो एसिड) मिलाया 1: 1 और hypotonic बफर में यंत्रवत् lysed। नाभिक और सेल घ को हटाने के बादकम गति centrifugation द्वारा ebris, लिपिड छोटी बूंद जुड़े प्रोटीन isotonic बफर में तीन चरणों धोने के बाद दो बाद में ultracentrifugation चरणों से समृद्ध कर रहे हैं। लिपिड छोटी बूंद अंशों की शुद्धता अलग subcellular डिब्बों को पहचानने एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया जाता है। लिपिड छोटी बूंद जुड़े प्रोटीन तो एसडीएस-पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) Coomassie धुंधला द्वारा पीछा से अलग होते हैं। tryptic डाइजेस्ट के बाद, पेप्टाइड्स तरल क्रोमैटोग्राफी-electrospray ionization-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ईएसआई-एमएस / एमएस) द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। इस विधि का उपयोग करना, हम एचसीवी संक्रमण पर लिपिड बूंदों कि प्रो- या एंटीवायरल मेजबान कारकों का प्रतिनिधित्व कर सकते करने के लिए भर्ती प्रोटीन की पहचान की। हमारे विधि इस तरह के रोगज़नक़ के संक्रमण, पर्यावरण के तनाव, या नशीली दवाओं के उपचार के रूप में विभिन्न कोशिकाओं और संस्कृति की स्थिति, की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।
(ट्राइग्लिसराइड्स (TG) और कोलेस्ट्रॉल एस्टर (सीई)) लिपिड बूंदों अत्यधिक गतिशील cytoplasmic (और परमाणु) सेल उदासीन लिपिड के एक प्रमुख से बना अंगों हैं एम्बेडेड प्रोटीन 1 के साथ फॉस्फोलिपिड की एक monolayer से घिरा। सभी प्रकार की कोशिकाओं लिपिड बूंदों का उत्पादन है, लेकिन वे आकार, लिपिड रचना, और प्रोटीन सजावट में भिन्नता है। लिपिड बूंदों ऊर्जा और झिल्ली अग्रदूत जलाशयों के रूप में या प्रोटीन जमा के रूप में सेवारत सहित विविध कार्यों को पूरा। इसके अलावा, लिपिड के तेज के माध्यम से, वे lipotoxicity से कोशिकाओं, रिहाई लिपिड संकेतन अणुओं के रूप में की रक्षा, और प्रोटीन गिरावट और जालिका (ईआर) तनाव प्रतिक्रियाओं 2 में शामिल हैं। जैसे, प्रोटीन के एक मेजबान लिपिड बूंदों के लिए बाध्य और अन्य अंगों के साथ उनकी पीढ़ी, गिरावट, तस्करी, और बातचीत तय करते हैं। उनमें से सदाशयी लिपिड छोटी बूंद बंधनकारी प्रोटीन की perilipin परिवार (PLIN1-5) कर रहे हैंच "> 3।
लिपिड छोटी बूंद जीवजनन संभावना ईआर, जहां ईआर-निवासी एंजाइमों उदासीन लिपिड कि झिल्ली दोहरी परत के भीतर जमा के संश्लेषण को उत्प्रेरित पर शुरू होता है, उदासीन लिपिड की एक लेंस, एक प्रक्रिया है कि हाल ही में खमीर 4 में अच्छी तरह से कल्पना की गई थी गठन। झुकने झिल्ली और बुलंद phosphatidic एसिड और diacylglycerol स्तरों तो फॉस्फोलिपिड जैव संश्लेषण में शामिल प्रोटीन को आकर्षित करने के लिए लगा रहे हैं, कोर उदासीन लिपिड और परिरक्षण फॉस्फोलिपिड के एक साथ संश्लेषण के रूप में लिपिड छोटी बूंद पीढ़ी 5 के लिए आवश्यक है। transmembrane डोमेन को शरण देने एंजाइमों कि ईआर में निवास इस प्रक्रिया को उत्प्रेरित। बड़े लिपिड बूंदों को विस्तार लिपिड synthesizing एंजाइमों कि एक amphipathic हेलिक्स बंदरगाह और इस तरह लिपिड बूंदों को ईआर से यात्रा कर सकते हैं की एक अलग वर्ग की गतिविधि की आवश्यकता है। लिपिड बूंदों से लिपिड को जुटाने triglycerid के स्थानीय सक्रियण के माध्यम से होता हैई और diacylglycerol lipases वसा ट्राइग्लिसराइड lipase (ATGL) और हार्मोन के प्रति संवेदनशील lipase (एचएसएल) या इस तरह के स्थूल और microlipophagy या के रूप में विभिन्न autophagic रास्ते, द्वारा संरक्षिका की मध्यस्थता भोजी 6। लिपिड बूंदों ऐसे माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में अन्य सेलुलर organelles, और ईआर (बीटा ऑक्सीकरण और लिपिड संश्लेषण के लिए) के साथ बातचीत, लेकिन (लिपिड संश्लेषण और प्रोटीन की तस्करी के लिए) भी लाइसोसोम, endosomes, और रिक्तिकाएं intracellular बैक्टीरिया 7 से प्रेरित है। दरअसल बैक्टीरिया, वायरस, और यहां तक कि परजीवी प्रतिकृति और दृढ़ता के लिए लिपिड बूंदों लक्षित करते हैं, उन्हें एचसीवी 8 के बीच में।
एचसीवी संक्रमण प्रति वर्ष 9 लगभग 0.5 मिलियन लोगों की मृत्यु के लिए लेखांकन जिगर संबंधी रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर के प्रमुख कारणों में से एक है। एचसीवी संक्रमण की सही संख्या अज्ञात है, लेकिन हाल के अनुमानों का सुझाव है कि 130 – 150 मिलियन लोगों लंबे समय से संक्रमित हैं। कोई VACCINई मौजूद है, लेकिन हाल ही में मंजूरी दे दी प्रत्यक्ष अभिनय विषाणु-विरोधी नाटकीय रूप से मानक इंटरफेरॉन आधारित चिकित्सा की तुलना में चिकित्सकीय प्रतिक्रियाओं वृद्धि हुई है। हालांकि, दुनिया भर में, रोगियों के उपचार की संभावना नई चिकित्सा विज्ञान के अत्यंत उच्च लागत की वजह से प्रतिबंधित कर दिया जाएगा। सभी व्यक्तियों के बारे में आधा लंबे समय से एचसीवी से संक्रमित वसामय यकृत रोग (स्टीटोसिस), एक शर्त हेपाटोसाइट्स में लिपिड बूंदों के अत्यधिक संचय की विशेषता का विकास। दिलचस्प, लिपिड बूंदों भी एचसीवी प्रतिकृति के लिए के रूप में महत्वपूर्ण सेलुलर organelles उभरा है, कथित रूप से वायरल विधानसभा साइटों 10, 11 के रूप में सेवारत।
एचसीवी से संक्रमित कोशिकाओं में, वायरल प्रोटीन कोर और NS5A, एक प्रक्रिया है कि ट्राइग्लिसराइड जैव संश्लेषण पर निर्भर करता है में लिपिड बूंदों को स्थानीय बनाना diacylglycerol acyltransferase -1 (DGAT1) के अवरोधकों के रूप में लिपिड बूंदों और बाद में एचसीवी कण उत्पादन से 12 तस्करी ख़राब </sup>, 13, 14, 15। इसके अलावा, या तो कोर या NS5A के लिपिड छोटी बूंद बाध्यकारी डोमेन में म्यूटेशन एचसीवी विधानसभा 16, 17 को दबाने। कोर और NS5A फिर अन्य सभी वायरल प्रोटीन, साथ ही वायरल आरएनए प्रतिकृति परिसरों की भर्ती, बारीकी से लिपिड के साथ जुड़े 16 बूंदों झिल्ली को। सभी वायरल प्रोटीन का एक ठोस की कार्रवाई संक्रामक वायरल संतान 10, 11 के सफल उत्पादन के लिए आवश्यक है। संरचनात्मक प्रोटीन virions की हिस्सा हैं, और nonstructural प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक बातचीत को बढ़ावा देने के। दिलचस्प, सदाशयी लिपिड छोटी बूंद बाध्यकारी प्रोटीन PLIN3 / TIP47 दोनों एचसीवी आरएनए प्रतिकृति और virions 18 की रिहाई, 19 के लिए आवश्यक है <sup>, 20। इन हाल के अग्रिमों के बावजूद, यंत्रवत विवरण, विशेष रूप से एचसीवी प्रतिकृति की देर चरणों के दौरान वायरस मेजबान बातचीत की, ख़राब ढंग से परिभाषित बने हुए हैं, और लिपिड बूंदों की सटीक समारोह अज्ञात है।
यहाँ, हम जुड़े प्रोटीन की मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लिपिड बूंदों को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि का उपयोग करना, हम एक मेजबान प्रोटीन है कि सह-fractionates लिपिड बूंदों के साथ और कुशल एचसीवी परिपक्वता 21 के लिए आवश्यक है के रूप में एचसीवी संक्रमण के दौरान लिपिड छोटी बूंद proteome में व्यापक परिवर्तन और पहचान Annexin A3 पाया।
यहाँ, हम संवर्धन और इस तरह के वायरल संक्रमण के रूप में विविध संस्कृति की स्थिति, के तहत लिपिड बूंदों के साथ जुड़े प्रोटीन की कमी की तुलना करने के मात्रात्मक लिपिड छोटी बूंद proteome विश्लेषण के लिए लिपिड बूं?…
The authors have nothing to disclose.
हम JFH1 का निर्माण, T वकिटा (राष्ट्रीय संस्थान के लिए JC1 निर्माणों के लिए आर Bartenschlager (हीडलबर्ग विश्वविद्यालय), Huh7.5 कोशिकाओं के लिए मुख्यमंत्री चावल (रॉकफेलर विश्वविद्यालय), J मैक्लौचलन (चिकित्सा अनुसंधान परिषद विषाणु विज्ञान यूनिट) धन्यवाद संक्रामक रोग, जापान) JFH1 के लिए, और बी वेबस्टर और वकी ग्रीन (विषाणु विज्ञान के ग्लैडस्टोन संस्थान और इम्यूनोलॉजी) HCVcc संवाददाता निर्माणों के लिए। इस काम DFG से धन द्वारा समर्थित किया गया (एचई 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 और संस्थान 337 / 16-1 2013 (एचएस))। हैन्रिक पे्ट संस्थान, प्रायोगिक विषाणु विज्ञान के लिए लाइबनिट्स संस्थान नि: शुल्क और हैम्बर्ग के Hanseatic शहर और स्वास्थ्य संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित है। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
NP-40 | AppliChem | A1694 |
TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
Suction Needles | Transcodent | 6482 |
Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
Orbitrap Fusion | ||
Branson Sonifier 450 | ||
Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
Infinite M1000 PRO | Tecan |