Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse
Summary
Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.
Abstract
Lipidtröpfchen sind entscheidend für die Replikation von einer Vielzahl von verschiedenen Krankheitserregern, am deutlichsten der Hepatitis-C-Virus (HCV), als die mutmaßliche Stelle Virionmorphogenese. Quantitative Lipidtropfen Proteomanalyse kann verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, zu lokalisieren oder von Lipidtröpfchen unter Bedingungen, wie Virusinfektionen verdrängt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das mit HCV erfolgreich eingesetzt, um die Änderungen in den Lipidtröpfchen Proteom zu charakterisieren nach der Infektion wurde. Wir verwenden Markierung mit stabilen Isotopen mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und damit die vollständige Proteom einer Population von Zellen, die mit „schweren“ Aminosäuren bezeichnen, die die Proteine durch Massenspektrometrie quantitativ zu bestimmen. Für Lipidtröpfchen Isolation, die beiden Zellpopulationen (dh HCV-infizierten / „Licht“ Aminosäuren und nicht infizierten Kontroll / „schwere“ Aminosäuren) sind 1: 1 gemischt und mechanisch in hypotonischen Puffer lysiert. Nachdem die Kerne und Zell d Entfernenebris durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, Lipidtröpfchen-assoziierte Proteine werden durch zwei aufeinanderfolgende Schritte Ultrazentrifugation durch drei Waschschritte in isotonischem Puffer angereichert folgte. Die Reinheit der Fraktionen wird Lipidtröpfchen durch Western-Blotting mit Antikörpern, die unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten analysiert. Lipidtropfen-assoziierte Proteine werden dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von Coomassie-Färbung aufgetrennt. Nach tryptischen Verdaus werden die Peptide durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS / MS) quantifiziert. Mit dieser Methode identifizierten wir Proteine rekrutiert Lipidtröpfchen auf HCV-Infektion, die pro- oder antivirale Wirtsfaktoren darstellen könnten. Unsere Methode kann mit Krankheitserregern, Umweltstress, oder medikamentöser Behandlung zu einer Vielzahl von verschiedenen Zellen und Kulturbedingungen, wie Infektionen angewandt werden.
Introduction
Lipidtröpfchen sind sehr dynamisch cytoplasmatischen (und nuklear) Zellorganellen , bestehend aus einem Kern aus neutralen Lipiden (Triglyceriden (TG) und Cholesterinester (CE)) durch eine Monoschicht von Phospholipiden mit eingebetteten Proteinen 1 umschlossen. Alle Zelltypen produzieren Lipidtröpfchen, aber sie unterscheiden sich in Größe, Lipidzusammensetzung und Protein Dekoration. Lipidtröpfchen erfüllen verschiedene Funktionen, unter anderem als Energie und Membranvorläufer Reservoire oder als Proteinablagerungen. Darüber hinaus wird durch die Aufnahme von Lipiden, schützen sie Zellen vor Lipotoxizität, Trenn Lipide als Signalmoleküle, und sind in den Proteinabbau und endoplasmatischen Retikulum (ER) 2 Stressantworten beteiligt. Als solche bindet eine Vielzahl von Proteinen an Lipidtröpfchen und regelt ihre Generation, Abbau, handelt, und die Interaktion mit anderen Organellen. Unter ihnen sind die perilipin Familie von bona fide Lipidtröpfchen bindende Proteine (PLIN1-5)f "> 3.
Lipidtropfen Biogenese beginnt wahrscheinlich am IHN, in dem ER-resident Enzyme die Synthese von Neutrallipiden katalysieren , die innerhalb der Membran – Doppelschicht ansammeln, eine Linse aus neutralen Lipiden gebildet wird , ein Verfahren , das in letzter Zeit in Hefe gut 4 sichtbar gemacht wurde. Membran Biegen und erhöhter Phosphatidsäure und Diacylglycerin Ebenen werden dann gedacht Proteine in Phospholipid – Biosynthese, wie die gleichzeitige Synthese der Kern neutralen Lipiden und Phospholipiden die Abschirmung für Lipidtröpfchenerzeugung 5 erforderlich beteiligt zu gewinnen. Enzyme beherbergen Transmembran- Domänen, die an der ER residieren katalysieren diesen Prozess. Expansion zu großen Lipidtröpfchen erfordert die Aktivität einer anderen Klasse von Lipid-synthetisierende Enzyme, die eine amphipathische Helix Hafen und kann somit aus dem ER zum Lipidtröpfchen reisen. Die Mobilisierung von Lipiden aus Lipidtröpfchen erfolgt durch die lokale Aktivierung des Triglyceride und Diacylglycerin Lipasen adipose Triglycerid – Lipase (ATGL) und hormonsensitive Lipase (HSL) , oder durch verschiedene Wege autophagischen wie Makro- und microlipophagy oder Chaperon-vermittelte autophagy 6. Lipidtröpfchen der Interaktion mit anderen Zellorganellen, wie Mitochondrien (zur beta-Oxidation und Lipid – Synthese) und ER (für die Lipid – Synthese und Proteintransport), sondern auch mit Lysosomen, Endosomen und den durch intrazelluläre Bakterien 7 induzierten Vakuolen. Tatsächlich Bakterien, Viren, Parasiten und sogar Ziellipidtröpfchen für die Replikation und Persistenz, darunter HCV 8.
HCV – Infektion ist eine der führenden Ursachen für Leberbedingte Morbidität und Mortalität weltweit, 9 für etwa 0,5 Millionen Todesfälle pro Jahr ausmacht. Die tatsächliche Zahl der HCV-Infektionen ist nicht bekannt, aber die jüngsten Schätzungen deuten darauf hin, dass 130-150000000 Menschen chronisch infiziert sind. kein vaccine existiert, aber die kürzlich genehmigten direkt wirkenden antiviralen Medikamente therapeutische Reaktionen drastisch erhöhen im Vergleich zur Standard-Interferon-basierten Therapie. Doch weltweit wird wahrscheinlich die Behandlung von Patienten beschränkt werden aufgrund der extrem hohen Kosten der neuen Therapeutika. Etwa die Hälfte aller Menschen chronisch mit HCV entwickeln Fettlebererkrankung (Steatose) infiziert sind, eine durch die übermäßige Ansammlung von Fetttröpfchen in Hepatozyten gekennzeichnet ist. Intriguingly, Lipidtröpfchen entstanden auch als vital Zellorganellen für die HCV – Replikation, mutmaßlich viral als Montagestellen dienenden 10, 11.
In HCV-infizierten Zellen, der virale Proteinkern und NS5A lokalisieren zu Lipidtröpfchen in einem Prozess, der auf Triglycerid – Biosynthese – 12, als Inhibitoren der Diacylglycerol – Acyltransferase-1 (DGAT1) beeinträchtigt Handel Lipidtröpfchen und nachfolgenden HCV Partikelproduktion hängt </sup>, 13, 14, 15. Darüber hinaus können Mutationen in den Lipidtröpfchen-Bindungsdomänen von entweder Kern oder NS5A unterdrücken HCV – Anordnung 16, 17 auf . Kern und NS5A dann alle anderen viralen Proteine rekrutieren, sowie virale RNA – Replikationskomplexe zu Membranen eng mit Lipid assoziierten Tröpfchen 16. Eine konzertierte Aktion aller viralen Proteine ist für die erfolgreiche Produktion von infektiösen Virusnachkommen 10, 11 erforderlich. Die Strukturproteine sind Teil der Virionen und die nicht-strukturellen Proteine fördern, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen für dieses Verfahren erforderlich. Erstaunlicherweise wird die bona fide Lipidtröpfchen-bindendes Protein PLIN3 / TIP47 sowohl für HCV – RNA – Replikation erforderlich ist und die Freisetzung von Virionen 18, 19 <sup> 20. Trotz dieser jüngsten Fortschritte, die mechanistischen Details, vor allem von Virus-Wirt-Interaktionen während der späten Stadien der HCV-Replikation, bleiben schlecht definiert, und die genaue Funktion der Lipidtröpfchen ist nicht bekannt.
Hier beschreiben wir ein Verfahren Lipidtröpfchen für die quantitative Massenspektrometrie assoziierter Proteine zu isolieren. Mit dieser Methode fanden wir grundlegende Veränderungen in den Lipidtröpfchen Proteom während eines HCV – Infektion und identifiziert Annexin A3 als Wirt Protein , das mit Lipidtröpfchen zusammen fraktioniert und ist für eine effiziente HCV Reifung 21 erforderlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll Lipidtröpfchen für quantitative Lipidtröpfchen Proteomanalyse zu isolieren, die An- und Abreicherung von Proteinen mit Lipidtröpfchen unter verschiedenen Kulturbedingungen, wie virale Infektionen zu vergleichen. bezogen auf das Gesamtspitzenintensitäten Als alternatives Verfahren kann die Proteomanalyse mit markierungsfreien Quantifizierungen durchgeführt werden. Dieses Verfahren hat keine dynamische Bereichsbegrenzung und vermeidet metabolische Probleme. Der Vorteil des SILAC An…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken R. Bartenschlager (Universität Heidelberg) für die Jc1 Konstrukte, CM Rice (Rockefeller University) für die Huh7.5 Zellen, J. McLauchlan (Medical Research Council Virology Unit) für die JFH1 konstruieren, T. Wakita (National Institute of Infectious Diseases, Japan) für die JFH1 und B. Webster und WC Greene (Gladstone Institut für Virologie und Immunologie) für die HCVcc Reporterkonstrukte. Diese Arbeit wird durch Mittel der DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 und INST 337 / 16-1 2013 (HS)) unterstützt wurde. Das Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie wird von den Freien und Hansestadt Hamburg und das Bundesministerium für Gesundheit unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.
Materials
| SILAC Protein Quantitation Kit – DMEM | Thermo Fisher | 89983 |
| 13C6 L-Arginine-HCl 50 mg | Thermo Fisher | 88210 |
| Roti-Load 1 | Roth GmbH | K929.1 |
| Roti-Blue 5x-Concentrate | Roth GmbH | A152.2 |
| 10x SDS-Tris-Glycine – Buffer | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A1415,0250 |
| GlutaMAX (100x) | Life Technologies GmbH | 350500038 |
| Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ml |
| PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | D8537 |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T3924-100ML |
| Sodium Chloride BioChemica | AppliChem GmbH | A1149,1000 |
| Tris Ultrapure | AppliChem GmbH | A1086,5000A |
| EDTA BioChemica | AppliChem GmbH | A1103,0250 |
| Protease Inhibitor Cocktail 5ml | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P8340-5ML |
| D(+)-Sucrose BioChemica | AppliChem GmbH | A3935,1000 |
| Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF | AppliChem GmbH | A0625 |
| DC Protein Assay | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 500-0116 |
| Glycerol | AppliChem GmbH | 151339 |
| SDS Ultrapure | AppliChem GmbH | A1112 |
| Bromophenol blue | AppliChem GmbH | A2331 |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem GmbH | A4338 |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 |
| Potassium Chloride | AppliChem GmbH | A1039 |
| Phenylmethanesulfonyl Fluoride | AppliChem GmbH | A0999 |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 221309 |
| Dipotassium Hydrogenphosphate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | P3786 |
| DTT | AppliChem GmbH | A2948 |
| NP-40 | AppliChem | A1694 |
| TWEEN 20 | AppliChem | A4974 |
| Nonfat dried milk powder | AppliChem | A0830 |
| Anti-ADFP/ ADRP | abcam | ab52355 |
| M6PRB1/TIP47 100µg | abcam | ab47639 |
| Calreticulin, pAb 200 µg | Enzo Life Science GmbH | ADI-SPA-600-F |
| Anti-ß-Tubulin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | T6074 200µl |
| Ethanol absolute | Geyer Th. GmbH & Co.KG | A3678,0250 |
| Anti-MnSOD | Enzo Life Science GmbH | ADI-SOD-110-F |
| Anti-mouse HRP | Thermo Fisher Pierce | 32430 |
| Anti-rabbit HRP | Thermo Fisher Pierce | 32460 |
| Amersham Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906836 |
| Lumi-Light Western Blotting Substrate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 12015196001 |
| 96 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 655 180 |
| Terumo Syringe 1 ml | Terumo | SS-01T |
| Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 µm | SARSTEDT | 83.1823.100 |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel | Bio-Rad Laboratoris GmbH | 456-9034 |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One GmbH | 657160 |
| Dishes Nunclon 150/20 | Fisher Scientific GmbH | 10098720 – 168381 |
| Cell Scraper | neoLab Migge GmbH | C-8120 |
| Tube, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 |
| SafeSeal Tube RNase-free | SARSTEDT | 72.706.400 |
| Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm | Beckman Coulter GmbH | 344062 |
| Suction Needles | Transcodent | 6482 |
| Biosphere Fil. Tip 1000 | SARSTEDT | 70.762.211 |
| Biosphere Fil. Tip 200 | SARSTEDT | 70.760.211 |
| Biosphere Fil. Tip 10 | SARSTEDT | 70.1130.210 |
| Dounce Tissue Grinder | Fisher Scientific GmbH | 11883722 |
| Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders | Fisher Scientific GmbH | 10389444 |
| Orbitrap Fusion | ||
| Branson Sonifier 450 | ||
| Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml | Eppendorf | 5355 000.127 |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply, | BioRad | 165-8033 |
| Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber | BioRad | 165-4110 |
| PowerPac HC Power Supply | Biorad | 164-5052 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Optima L-90K | Beckman Coulter GmbH | 365670 |
| SW 60 Ti Rotor | Beckman Coulter GmbH | 335649 |
| Infinite M1000 PRO | Tecan |
References
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