Summary

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Published: April 22, 2017
doi:

Summary

İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.

Abstract

Blastosist (genellikle üçüncü gün E3.5 de) iç kütleden izole fare embriyonik kök hücreleri (ESCs), erken dönemde embriyo gelişimini incelemek için in vitro model sistemi olarak da kullanılabilir. lösemi inhibe edici faktör (LİF) yokluğunda, EKH nöral öncü hücrelerine varsayılan göre farklılık göstermektedir. Onlar yüzünden erken evre embriyo olan benzerliği küresel agrega Embriyoit gövdeyi (EB) adı verilen üç boyutlu (3D) içine topladığı edilebilir. EBS iki boyutlu (2D) uzantıları büyüterek genişletmek nerede, fibronektin kaplı lamelleri numaralı seribaşı, ya da küremsiler olarak büyümeye devam ve üç germ içine ayırt 3D kollajen matrislerinde implante edilebilir: endodermal, mezodermal ve ektodermal. 3D kollajen kültür 2D EBS daha yakından in vivo ortamda taklit eder. 2B EB kültür immunfloresan ve farklılaşmayı izlemek için imünolekelemeyle analizini kolaylaştırır. Biz iki adımlı nöral differentia geliştirdiksiyon protokolü. Birinci aşamada, EBS aynı zamanda, retinoik asit (RA) maruz bırakılarak ayırt etmek için uyarılan, asılı bırakma tekniği ile üretilen ve edilmektedir. İkinci aşamada, RA yokluğunda bir 2D veya 3D biçiminde sinir farklılaşma ilerler.

Introduction

EKH blastosist iç hücre kitlesi kaynaklanır. Menşe organizmanın herhangi bir hücre türü ayırt etme kapasitesine sahip, yani bu hücreler, embriyonik dokuda bulunurlar. ESC in vitro farklılaşma geliştirme yolunu ve mekanizmaları araştırmak için bir sistemde kadar geniş ilgi konusudur. Bu hücre ve doku disfonksiyonu düzeltmek için, yeni tedavi yaklaşımları test etmek için bir kuvvetli ve esnek bir model sistem sunmaktadır. EBS erken embriyogenez sırasında hücre farklılaşması birçok yönünü yeniden gündeme getirirler. Embriyo ölümüne yolaçtığı zor embriyonik kusurlar 1, 2, hücresel bir temel belirlemek için yapar Özellikle, EBS kullanılabilir. EBS asılı bırakma veya bir sıvı süspansiyon teknikleri 3 yoluyla oluşturulabilir. Eski avantajı böylece deneysel tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak tutarlı boyut ve yoğunluğu EBS üretme yeteneğidir.

<p ckız = "jove_content"> hücre dışı matris (ECM) yapışma proteinleri ile etkileşim yapışan hücre motilitesi ve hayatta kalmayı etkiliyor olabilir. 2B kültür sisteminde, fibronektin genellikle substrata hücre yapışmasını arttırmak için uygulanır. Fibronektin heterodimerleri 4 integrin hücre yüzeyine 10 türleri tarafından tanınan bir bazal lamina bileşenidir.

RA sinir farklılaşmasını 5, 6 indükler A vitamini küçük lipofilik metabolitidir. RA yüksek konsantrasyonlarda sinir gen ekspresyonunu teşvik etmek ve EB formasyonu 7, 8 boyunca mezodermal geni ifade etmek. RA retinaldehit dehidrojenaz 9 tarafından nihai ürüne retinaldehit oksidasyon takip eder ya da alkol ya da retinol dehidrojenazı ile, retinaldehit için bir oksidasyon vitamini ile üretilir. Sinir farklılaşma sitoplazmadan RA taşınmasını gerektirir Hücresel RA-bağlayıcı protein 2 (CRABP2) ile çekirdeğe. Çekirdekte RA, RAR-RXR heterodimerin 10 oluşan bunun kognat reseptörü kompleksine bağlanmaktadır. Bu transkripsiyonel eş-aktivatörleri alımı ve transkripsiyon 9, 11 başlatılması ile sonuçlanır. Ayrıca, RA ve böylece BMP ve Smad 12 sinyal antagonize fosforile (aktif) SMAD1 bozunmasını geliştirmesidir. Bu faaliyetlerin yanı sıra, RA Pax6 ifadesini nöral farklılaşma 13 destekleyen bir transkripsiyon faktörü artar. RA sinyal sirtuin-1 (SIRT1), nükleer nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +) 'modüle edilir – çekirdeğe translokasyonu ile müdahale, CRABP2 deacetylates bağlı bir enzim ve bu nedenle RA, RAR-RXR heterodimerin 14, 15 bağlanma ile, 16.

e_content "> Burada anlatılan RA-tedavi EB protokolünü tasarlarken amacımız nöronal öncü hücrelerine ESC farklılaşmasını regüle sinyal yollarının in vitro analizini kolaylaştırmak amacıyla nöral farklılaşma optimize etmektir. Bu protokolün avantajlarından biri kolaylaştırılmasıdır immünfloresans. 3D EBS tarafından hücre fonksiyonunun analizi de antikorlar tarafından nüfuz ve nöral farklılaşma odaklı mikroskopi ile immunolabeling ve hücrelerin görüntüleme kolaylaştırır sırasında belirli zaman noktalarında 2D tek tabaka halinde görüntü. EB ayrışma zordur değildir.

Protocol

Fare embriyonik fibroblastlar 1. Kültür (MEF'ler) MEF orta hazırlayın,% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM yüksek glukoz). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (RT),% 0.5 jelatin çözeltisi ile kaplayın 100 mm'lik bir hücre kültür tabakları. Bir Sitometreyi kullanılarak MEFS sayın. jelatin çözeltisi çıkarın ve hemen MEF ortamı 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılmış dökün. Hızla, daha sonra 2 dakik…

Representative Results

Oct4, Nanog ve Sox2 ESC kendini yenileme ve pluripotensini veren çekirdek transkripsiyon faktörleridir. Vahşi tip ve Syx, RhoA spesifik değişim faktörü Syx kodlayan bir gen, bozulur genetik olarak modifiye edilmiş bir fare suşundan elde ESC'lennin nöral farklılaşmasını karşılaştırma yukarıdaki protokol uygulanmıştır. Biz anjiyogenez 18'de syx karıştığı almıştı. / – – EKH ve syx nöral fark…

Discussion

Bu protokolde, kemirgen ESC'lennin nöral farklılaşma çalışma için nispeten basit ve erişilebilir bir yöntem sunulmaktadır. Daha önceki protokollarda, RA günde 2 veya EB asılı damla, 8 gün 4 veya süspansiyon kültürü 7 tarafından ortam ilave edildi, EB damla agregasyonu 21 asılı, sırasıyla, ya da hemen sonra. Biz icat Protokolde, RA daha önce eklenmiştir. Süspansiyon kültürü ile oluşturulmuş EBS için RA'nın da…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma AH NIH hibe R01 HL119984 tarafından desteklenmiştir

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

References

  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  3. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
  4. Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
  5. Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
  6. Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
  7. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
  8. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
  9. Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
  10. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
  11. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
  12. Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
  13. Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
  14. Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
  15. Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
  16. Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
  17. Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
  18. Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
  19. Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  20. Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
  21. Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
  22. Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
  23. Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
  24. Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
  25. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
  26. Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).

Play Video

Cite This Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

View Video