Summary
Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.
Abstract
Elektroporasyon, genleri tavuk embriyo gibi biyolojik açıdan önemli organizmalara tanıtan bir yöntemdir. Tavuk embriyonunun işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik işlevlerini incelemek için etkili bir araştırma modeli olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, tavuk embriyo, işitme ile ilişkili gen ekspresyonu, düzenlenmesi ve işlevinin incelenmesinde özellikle değerli hale geldi. Ovo elektroporasyonu, son derece uzmanlaşmış işitme işlevlerinden sorumlu işitsel beyin sapı bölgelerini hedeflemek için kullanılabilir. Bu bölgeler tavuk çekirdeği magnocellularis (NM) ve çekirdek laminaris (NL) içerir. NM ve NL nöronları rhombomerlerin 5 ve 6 (R5 / R6) 'nın belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bu bölgelerdeki gen ile ilgili özellikleri incelemek için plasmidle kodlanmış genlerin ovo elektroporasyonunda sunuluyoruz. Fonksiyonel fenotipin kazanılmasını veya kaybedilmesini teşvik eden, gen ifadesinin mekânsal ve zamansal kontrolü için bir yöntem gösteriyoruzes. R5 / R6 ile ilişkili işitsel nöral progenitör bölgeleri hedefleyerek, NM ve NL'de plazmid transfeksiyonunu gösteririz. Gen ekspresyonunun zamansal regülasyonu bir tet-on vektör sistemi benimseyerek başarılabilir. Bu, doksisiklinin (Dox) varlığında ilgilenilen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür. İn ovo elektroporasyon tekniği - ya biyokimyasal, farmakolojik ve / veya in vivo fonksiyonel testlerle - birlikte, işitsel nöron gelişimini ve buna bağlı patofizyolojik olayları incelemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Sesin hızlı sinirsel kodlaması normal işitme işlevleri için gereklidir. Bunlar arasında ses lokalizasyon yetenekleri 1 , gürültü ayırımı 2'deki konuşma ve davranışsal olarak diğer iletişim sinyallerinin anlaşılması 3 bulunur . Hem kuşların hem de memelilerin işitsel beyin sapında bulunan benzer nöronlar, hızlı sinirsel kodlama 4 için son derece uzmanlaşmıştır. Tavuk çekirdeği magnocellularis (NM), çekirdek laminaris (NL) ve bunların memeli analogları, anteroventral koklear çekirdek (AVCN) ve sırasıyla medial superior zeytin (MSO) 5 içerir . Bununla birlikte, hızlı sinirsel kodlamayı düzenleyen gelişim mekanizmaları, işitsel beyin sapında çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, hızlı inal kodlamadan sorumlu belirli genleri au'da ifade, düzenleme ve işlevlerini daha iyi anlamak için incelemek avantajlıdırDitory gelişme.
Gelişmekte olan tavuk embriyo, işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik sorularını incelemek için etkili ve köklü bir araştırma aracıdır 6 , 7 . Son moleküler ilerlemeler, gelişmekte olan tavuk embriyosundaki bu biyolojik soruları , in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri çürüterek veya çürüterek ele almıştır 8,9 . Spesifik genlerin düzenleyici rolünün araştırılması, işitsel açıklarla ilişkili patolojilerin anlaşılmasında önemli bir gelişmedir. Burada, plazmid kodlu genlerin, hızlı nöral ses kodlamasının gerçekleştiği tavuk işitme beyin sapı içine ovo elektroporasyonunda sunuyoruz. 5 ve 6 no.lu rhombomeres 11 , 12 ile birlikte görülen işitsel sinirsel progenitör bölgeleri hedef alarak (R5 /R6), biz NM ve NL plazmid transfeksiyon mekansal kontrol göstermektedir. Buna ek olarak, bir tet-on vektör sistemi benimseyerek ifadenin zamansal düzenlenişini gösteriyoruz. Bu, doksisiklinin (Dox) 8 varlığında ilgilenen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberleri Ulusal Enstitüleri uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. Yumurta Taşıma
- Gübrelenmiş yumurtaları yerel bir satıcıdan satın alın. Kuluçka öncesi en fazla 5 gün boyunca yumurtaları 13 ° C'de bir buzdolabında saklayın. Embriyo canlılığı, 1 hafta sonra belirgin şekilde azalır.
- Kuluçka makinesi koymadan önce her yumurta% 70 etanol ile sürün.
- Yaklaşık% 50 nemde sıcaklık 38 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde 1-2 düzine yumurta koyun. Bu, sırasıyla, elektroporasyon ve uygun canlılık için uygun embriyo konumlandırma sağlar.
NOT: 48-52 saat kuluçkadan sonra, yumurtalar ~ 12-13 Hamburger-Hamilton (HH) evresinde olacak ve elektroporasyon için hazır olacaktır.
2. Hazırlık
- Mi plazmasıxing
- Her 7 mcL DNA karışımı için 1 μL% 0.1 hızlı yeşil (18 MΩ deiyonize ve damıtılmış H2O [ddH2O] içinde% 0.1) ilave edin.
- Birden çok plazmitin birlikte elektroporasyonu için plazmidleri 1: 1 oranında karıştırın. Nihai DNA konsantrasyonu 5-8 μg / μL olmalıdır.
- Dolgu Enjeksiyonlu Pipet
- Bir mikropipet çekicide pipetleri çekin. Bir 28G şırınga iğnesi kullanarak 1-2 mcL plazmid pipet doldurun.
- Forsep kullanarak pipet ucunu 10 - 20 μm'ye kadar kesin. Kırılmış pipet ucunun boyutunu belirlemenize yardımcı olması için bir mikroskop kullanın. Pikspiritör pipet tutucusuna pipet takın.
3. Pencereleme
NOT: Pencereleme prosedürü 13'ten önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen referans 13'e bakınız.
- Tüm malzemeleri ve çalışma alanını% 70etanol.
- Kuluçka makinesinden istenilen sayıda yumurta alın (6-10 arası), oda sıcaklığında bırakın ve ayrı ayrı% 70 etanol içeren yumurtaları sürün. Kuluçka makinesinin çıkartılmasından sonra yumurtalar en az 2 saat süreyle canlı kalır.
- Embriyo konumlandırmayı tanımlamak için yumurtayı hafif bir aydınlatıcının üzerine yerleştirin. Karanlık bölgenin merkezini ( yani embriyo) bir kurşun kalemle daire haline getirin.
- Bir 19G iğne kullanarak, yumurtanın künt ucundaki bir delik açın.
- Yumurtanın sivri tarafındaki çizilmiş çemberin yakınındaki bir başka delik açın. 19G iğne ile dış yumurta kabı (yaklaşık 16 mm 2 ) küçük bir parça çıkarın ve sonra forseps ile iç yumurta kabuğunun (yaklaşık 8 mm 2 ) küçük bir parça çıkarın.
- 19G'lik bir iğne takılmış 3 mL şırınga ile yumurtadan künt uç deliğinden 1.5-2.5 mL albümini geri çekin. İğneyi 45 ° açıyla aşağıya açtığınızdan emin olun.
- Kör uç deliğini küçük bir bant parçası (1 cm x 1 cm) ile örtün. Çizilen daireyi veD ikinci deliğin bantla (2.5 cm x 4 cm).
- Kıvrımlı makas (kesme kenarı = 2.5 cm) ile, bir pencereyi daire içinde kesin. Makas yumurta kabuğuna paralel olmalıdır ve pencerenin çapı 2 cm'den az olmalıdır.
4. Plasmid Enjeksiyonu
- Pikristin cihazını açın. Basıncı 18 psi ve süresi 5 μs olarak ayarlayın. Diseksiyon mikroskopu için hava tankını ve lambayı açın.
- Steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karışık bir mağaza satın Hint mürekkebi 1: 10 seyreltme 30 ml stok solüsyonu olun. 4 ° C'de saklayın. Hint mürekkebinin enjeksiyonu, tavuk embriyonunun daha iyi görselleştirilmesi için önemli bir adımdır.
- Seyreltilmiş Hint mürekkebi çözeltisi ile 1 mL şırınga doldurun. 27G'lik bir iğne takın ve şırıngadaki mevcut kabarcığı dışarı atın.
- Embriyonun 2-3 mm kadar solüsyonunu hemen sarısı membranın altına yerleştirin ve ~ 0.2 mL Hint mürekkebi yavaşça embriyo altına enjekte edin. YapEmbriyonun sağkalımını azaltabileceğinden, Hint mürekkebinin 0.5 mL'den daha fazla enjekte edilmemelidir.
- Pencere yumurta diseksiyon mikroskopu altında bir yumurta tutucu yerleştirin. Plazmid enjeksiyon bölgesinin en iyi görselleştirilmesi için en yüksek büyütmeyi kullanın.
- Forseps kullanarak membranı enjeksiyon bölgesi üzerinden çıkarın. Dikkat çekici işitsel beyin sapı bölgeleri ( ör . NM ve NL) Rhombomeres 5 ve 6'dan (R5 / R6) ortaya çıkar. R5 / R6, R5 / R6 plasmid enjeksiyonları için yer işaretleri olarak görev yapan otokistlere (omurgalılarda embriyonik yapı, iç kulağa doğru gelişir) bitişik olarak bulunur.
- DNA dolgulu pipeti, R5 / R6 bölgesini örten sinir tüpüne ve mikromanipülatörü kullanarak otokistler arasına indirin. Şekil 1A'da ideal yerleşim şeması gösterilmektedir.
- Sinir tüpünde DNA çıkarmak için pikspritzerden hava basıncı (18 psi, 5 μs süre) uygulayın.
5. Elektroporasyon
- Aç şunuO akım / voltaj uyarıcısı.
- PBS ile 3 mL enjektör doldurun ve şırınga filtresini takın. Embriyo üzerine 1-2 damla PBS ekleyin.
- Enjeksiyon yerinin üstünde negatif elektrot (medial) ve R5 / R6'ya ( Şekil 1A ) yan tarafta bulunan pozitif elektrot ile mikromanipülatörü kullanarak bipolar elektrodu embriyoya indirin. Embriyo ile doğrudan temastan kaçının. Elektrot malzemesinin platinyum iridyum olduğu yerde iki kutuplu elektrot kullanın. İpuçları arasındaki boşluğu forseps ile 0,5 mm'ye ayarlayın.
- Bir akım / voltaj uyarıcısı kullanarak, 1 sn aralıklarla 1 ms için 50 V'de 20 kez darbe uygulayın.
- Elektroporasyondan sonra, maruz kalan alanın üzerine bir damla PBS ekleyin. Nazikçe elektrodu çıkarın ve bir laboratuvar dokusu ve% 70 etanol ile temizleyin. Bez ile embriyo ortaya pencere kapatın.
- Enjekte edilen plasmid tipi ve kuluçka tarihi ile yumurta kabuğunu etiketleyin.
- Pencereyi yukarı gelecek şekilde yumurtaları kuluçka makinesine yerleştirin. 38 ° C'de 50 ° C'de inkübe edinİstenen gelişim aşamasına gelene kadar nem%.
- Bir tet-on vektörü, gen ekspresyonunun zamansal kontrolü için elektroporasyona tabi tutulursa, gen ekspresyonunu başlatmak için 24 saatte bir Doxycycline (Dox) uygulayın (bkz. Bölüm 6).
6. Gen İfadesinin Zamansal Kontrolü için Tet-On Sistemi
- Aşağıdaki plazmidleri kullanın:
PCAGGS-T2TP: bir transposaz ifade eden plasmid.
PT2K-CAGGS-rtTA-M2: Dox bağlayıcı proteini istikrarlı bir şekilde ifade eden bir plazmid.
PT2K-BI-TRE-EGFP: EGFP raportörünün ve ilgili ikinci bir genin çift yönlü tet-on promotörünü (TRE) tetikleyen ekspresyonunu içeren bir plazmid.
NOT: Yukarıdaki üç plasmidin 1: 1: 1 oranla birlikte elektroporasyona tabi tutulması gerekir. - Stok çözeltisi hazırlama:
- 1 mg / mL stok çözeltisi üretmek için Dox steril PBS'de eritilir. -20 ° C'de saklayın.
- Dox uygulaması:
- Ekspiroyu teşvik etmekBelirli gelişim evreleri boyunca ilgilenilen genin n'si Dox'u 24 saatte bir uygulayın.
- Dox uygularken, yumurtayı çıkarın, pencereyi açın, 50 uL Dox'u koryoarotomatik zara pipetleyin, pencereyi kapatın ve kuluçka makinesine yumurtayı geri koyun.
7. Beyin Fırtınası Dilimleri İçin Diseksiyon Alanının Hazırlanması
NOT: Aşağıdaki bölümler (7 - 9) ve prosedürler 14'den önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen bu referanslara bakın.
- Bir agar solüsyonu hazırlayın (40 mg / mL agaroz, yani % 4 ddH20). Agar solüsyonunu bir Petri kabına dökün ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Dokunun beyin sapı dilimlemesi sırasında gelecekte kullanılmak üzere kapalı agar plakasını buzdolabında saklayın.
- Yapay serebral omurga sıvısı (ACSF)% 95 O 2 ve% 5 CO 2 (pH 7.2-7.4 ve ozmolarite: 295-310 mOsm / L) sürekli kabarcıklar.
- Çalışma alanını ve vibratomu% 70 EtOH ile temizleyin ve bıçağı damıtılmış su ile durulayın.
- Uygun diseksiyon aletleri ile çalışma alanına temiz bir sıvı emici ped koyun.
- Agar plakasını buzdolabından alın, küçük bir agar küveti kesin (10 mm x 10 mm x 8 mm). Ticari olarak mevcut superglue kullanarak bir vibratome dilimleme odasının aşamasına agar blok Tutkal.
8. Tavuk İşitsel Beyin Fırtınasının İzolasyonu
- Yumurtayı bantlanmış pencere alanından açın. Membran kese bir neşter ile delin ve tavuk embriyo başını çıkarın.
- Tavuğu keskin makasla kes.
- Tıraş bıçağı ucunu gözlerin arkasından hafifçe yerleştirin. Kafatası ile kaudal orta çizgide kafatası yoluyla incise edin. Embriyonun yaşına bağlı olarak hafif basınç uygulayın. Eski embriyolar daha fazla baskı gerektirir.
- Kafatasını ortaya çıkarmak ve orta hat kesimini doğrulamak için yavaşça cildi ve tüyleri itin.
- UygulanıyorTrunk basıncında, kafatasının rostral bölümünü bir ustura bıçağı ile kes. Bıçağı hemen gözlerin arkasına yerleştirin ve tüm kafatası ve beyin dokusunu kesin.
- Başın iki yanındaki boyun kaslarının biraz önündeki, kafatasının kaudal bölgesindeki makasla orta hattan insana insizyon yapın.Kafatasını ve fazla dokuyu çekerek beyin ve beyinciği açığa çıkarın.
- Makasla beyin sapına yapışmış dokuyu kesin ve kafatasından rahatça ayıran beyin sapını çıkarın.
9. İnvivo Elektrofizyoloji veya Görüntüleme için Beyin Fırtınası Dilimlerinin Hazırlanması
- Beyin sapını optik tectadan geçirin.
- Serebellumu, dördüncü ventrikülün zemini açığa vurarak, makaslarla pedankülleri keserek çıkarın.
- Cımbız kullanarak, membranöz doku ve kan damarlarını beyin sapı yüzeyinden çıkarın.
- Beyin kökeneğini engellemek için, dört katın en rostral ucunda yatay bir kesim yapınKortekste sadece kaudal olan ventrikül. Beyin sapını izole etmek için optik tecta lateral kesikler dikey yapın.
- Agar bloğunun hemen önündeki vibratome sahnesine az miktarda süper tutkal yerleştirin.
- Cımbız kullanarak omurgadaki beyin sapını kaldırın ve rostral yüzü aşağı bakan ve dorsal tarafı vibratome bıçağına doğru tutturun. Fazla tutkal bir laboratuvar dokusu veya filtre kağıdı ile çıkarın.
- Vibrasyonlu sahneye oksijenli ACSF dökün. Vibrasyonlu bıçağı 20-22 ° açı ile ayarlayın. Maksimum genlik salınımında vibratome başlatın. Sahneyi bıçağa doğru yukarı hareket ettirin, böylece dokunun üst kısmı bıçakla paraleldir.
- Bıçağı beyin sapı dokusuna doğru hızla hareket ettirin. Bıçağın doku ile temasından önce bıçağı yavaşça yavaşlatın.
- Doku mümkün olan en yavaş ilerleme hızıyla kes. Bıçak tüm koronal doku bölümünden geçtikten sonra, bir transfer pipetini kullanarak dilimi hafifçe çıkarın. </ Li>
- Aşamayı 200-300 μm altına indirin ve tekrar dilimleyin. İşitsel çekirdeklerin anatomik işaretleri görünene kadar tekrarlayın; örneğin, NL'nin belirgin dorsal / ventral nöropil bölgesi ve NM'nin NL'ye göre medial konumu.
- ACFS'de dilimleri dikkatlice muhafaza edin. Bu oda sıcaklığında (22 ° C) veya fizyolojik koşulların (~ 41 ° C) sıcak su banyosu kullanılarak yapılabilir. Dilimleme sırasına dikkat edin. İlk dilim en kaudal doku bölgesine karşılık gelir ve son dilim en rostral bölgeye karşılık gelir. Bu kabaca sırasıyla düşük frekanslı frekans bölgelerinden yüksek frekanslı kodlama bölgelerine yapılan işitsel beyin sapının tonotopik organizasyonunu temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovo elektroporasyonunda normal olarak gelişen bir biyolojik sistemde gen ifadesine izin verdiğini burada gösteriyoruz. Plasmid ile kodlanmış genler, R5 / R6 üzerinde bulunan sinir tüpüne fokal olarak enjekte edilir. Önemli anatomik belirteçlere göre elektrod ve pipet yerleşimlerinin şematik bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Plazmid enjeksiyonunun doğru konumu, elektroporasyondan 24 saat sonra doğrulanır ve Şekil 1B'de gösterilir. R5 / R6 üzerine yerleştirilen sinir tüpüne hedeflenen plazmid enjeksiyonu, spesifik işitsel beyin sapı bölgelerinde, yani NM ve NL'de ekspresyona izin verir (11) . Şekil 1C , diferansiyel interferans kontrast (DIC) aydınlatma altında bir E12 embriyo'sundan bir in vitro beyin sapı dilimini göstermektedir. İşitsel bölgelerin ana hatları çizilmiştir. Floresan aydınlatma ile ( Şekil 1C 1 ), YFP, N içerisindeki nöronları ifade ederM ve NL görülebilir. Şekil 1D , yüksek büyütme altında bir E18 embriyo için DIC aydınlatmasını göstermektedir. Çok sayıda NM nöronunun klasik adendritik hücre gövdeleri belirgindir. Floresan aydınlatma ( Şekil 1D 1 ) ile, NM neuronunu ifade eden bir YFP açıkça görünürken diğer nakledilen nöronlar odak düzleminin dışındadır. Hedeflenen NM bölgesindeki nöronların yalnızca bir kısmı transfekte edildiğinden çift çekme-kelepçe elektrofizyolojisi deneyleri sırasında aynı çekirdek içindeki diğer nöronların dahili kontrol olarak görev yapmasına izin verir. Transgenler, aynı zamanda, kesin gelişim dönemlerinde 8 gen ekspresyonunu ve manipülasyonunu mümkün kılan ilaç uygulamasıyla geçici olarak düzenlenebilir.
Şekil 1: Tavuk Au'da Ovo ElektroporasyonundaBeyin sapı. ( A ) HH evre 12 tavuk embriyolarının arka planında elektroporasyon şeması. Enjekte edilen pipeline plasmid DNA ve hızlı yeşil boya doldurularak enjekte edilen arka uç beyin görünümü sağlanır (rhombomeres 5/6 [R5 / R6]). Bu çalışmada, ilgilenilen bir genin birlikte sentezlendiği bir plasmid ve sarı-flüoresan proteini (YFP) muhabiri kullanıldı. Elektroporasyona tabi tutulan embriyolar, arzu edilen gelişim aşamasına gelene kadar tekrar inkübe edilir. ( B ) Embriyonik (E) 4üncü tavuk embriyosu, YFP ifadesinin sol göze (ok, E) ve sol otokiste (ok, O) göre yerini göstermektedir. Kesikli beyaz çizgi, dorsal beyin ve beyinsapı sınırını temsil eder. Ölçek çubuğu = 480 μm. (DIC, C ) ve flüoresan (YFP, C 1 ) aydınlatması altında bir E12 tavukundan ( C ve C 1 ) Brainstem dilimi (300 um kalınlık) n. Çizgili beyaz çizgiler, çekirdek magnosellularis (NM) ve çekirdek laminaris (NL) sınırlarını temsil etmektedir. Not, beyin sapı dilimi dokunun sadece bir tarafını gösterir. İçindeki beyaz ok uçları beyin sapı diliminin orta hat yarıkmasını temsil eder. Beyaz oklar, YFP'nin NM ve NL bölgelerini ifade ettiğini göstermektedir. V = ventral, M = medial. Ölçek çubuğu = 240 μm. ( D ve D 1 ) NM ihtiva eden bir E18 tavuk embriyo beyin sapı diliminin yüksek büyütme (80X suya daldırma objektifi). Klasik adendritik hücre cisimleri 15 , DIC aydınlatması altında açıkça görülebilir (yukarı ok, D ). Aynı dilim için flüoresan aydınlatma ile, YFP floresansıyla tanımlanan bir transfekte NM nöronu açıkça görünür (yukarı ok, D 1 ). Yıldız = YFP, odak düzleminin hemen altındaki NM nöronlarını ifade eder. Ölçek çubuğu = 30 μm.Large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovo elektroporasyonunda in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri eksprese eden veya yere seren bir yöntem 8 , 9 . Tavuk embriyosunda plazmid kodlu genleri farklı işitsel beyin sapı bölgelerinde ifade etmek için yenilikçi bir yöntem 8 . Optimal ifade sağlamak için birkaç kritik adım gereklidir. İlk olarak, yalnızca otokistleri açıkça görülen embriyolar enjekte edin. Otokistler görünür değilse, embriyo elektroporasyon için doğru gelişim aşamasında değildir. İkincisi, daha küçük pipet uçları, sinir tüpüne nüfuz etmeyi kolaylaştırır ve daha az doku hasarı ile sonuçlanır. Bununla birlikte, kırık uç DNA'yı dışarı atacak kadar büyük olmalıdır. Üçüncü olarak, R5 / R6'nın üzerindeki tüm sinir tüpünü DNA ile doldurun (hızlı yeşil solüsyonun yayılması ile görselleştirilir). Son olarak, stimülatör elektrodunun mümkün olduğunca embriyo yakınına yerleştirilmesi important. Bununla birlikte, akım darbeleri dokuları kızartıp hasarlandırabileceğinden, embriyo ile doğrudan temastan kaçının.
Tekniğin değiştirilmesi embriyoların canlılığını ve plazmidlerin ifadesini geliştirmeye yardımcı olabilir. İlk olarak, yüksek canlılığı korumak için gelişin 24 saatinde yumurtaları ayarlamak önemlidir. İkincisi, yetersiz bir mühürle embriyo ölümünü arttırdığı için, yumurta penceresi akışkan kaybı ( yani dehidrasyon) bantla sıkıca kapatılmalıdır. Üçüncü olarak, otokistin görselleştirilmesini optimize etmek için mümkün olan en az mürekkebi kullanarak embriyonun rostral tarafındaki Hint mürekkebi enjekte edin. Son olarak, uyarıcı elektrotlar, akım kuvvetini arttırmadan elektrikle yüklü alanı yaymak için R5 / R6 bölgeleri arasında hafifçe hareket ettirilebilir.
Yukarıdaki önerilere rağmen sınırlamaların var olduğuna dikkat edilmelidir. Bunlar, transfekte nöronların değişken oranları, beyin sapı dilimleri içindeki yerleri veEmbriyo sağkalım. Transfeksiyon etkinliği embriyolar arasında değişmekle birlikte, burada daha önce açıklanan elektroporasyon parametresi ile bildirilmiştir [NM / NL nöronlarının% 5-10'u sürekli olarak transfekte edilmiştir] 8 . Daha yüksek oranda nöronal transfeksiyonda bile, in vitro patch-clamp elektrofizyolojisi için beyin sapı dokusunun hazırlanması zorluklar ortaya koymaktadır. Örneğin, beyin sapı dilimleri 200 - 300 μm arasında kalınlıktadır ve bazen, transfekte edilen nöronlar fonksiyonel testleri yeterince yamalamak ve gerçekleştirmek için doku içinde çok derindir. Son olarak, transfeksiyon oranı kadar olmasa da, başarılı elektroporasyondan sonra embriyo sağkalımı da değişkendir. Deneysel kullanım için arzu edilen embriyo yaşına bağlı olarak, hayatta kalma değişkenliği% 80-20 arasında öfke gösterebilir; bu embriyo en son embriyolara karşılık gelir (> E18).
Tavuklarda in ovo elektroporasyonunun önemi memeli model sistemleri üzerinde birkaç r için avantajlıdır Easons 16 . Birincisi, nispeten ucuz ve transjenik veya nakavt hayvanlarına mükemmel bir alternatiftir. İkincisi, tavuk, hücresel, sinaptik ve sinir ağı düzeyinde sesin zamansal bilgisini işleyen memelilerle benzer çekirdekleri paylaşır. Benzer işitme işlevine bir örnek, memelilerde AVCN / MSO ve tavşanlarda NM / NL, benzer işitsel beyin sapı yapıları sırasıyla 4 , 5 arasında meydana gelir. Bununla birlikte, fareler ve sıçanlar gibi geleneksel yüksek frekanslı işitme amaçlı memeli araştırma modellerinin aksine, tavuklar, işitsel bilgileri kodlamak için hem düşük frekanslı hem de yüksek frekanslı sinyallerle verilen ipuçlarını kullanırlar. Son olarak, tavuklar işitme güçlüğü çeken hayvanlardır; Yani, işitme sistemi doğumda işlevsel olgunlaşma yakınında ve işitmenin başlangıcı ve inceliği embriyonik aşamalar sırasında çevresel etkiler olmadan gerçekleşir19 , 20 . Buna karşılık, tipik memeli araştırma modelleri için işitmenin başlangıcı doğumdan 10-13 gün sonra başlar 21 , 23 .
Ovo genetik manipülasyonlarında, biyokimyasal, farmakolojik ve fonksiyonel testlerle bağlantılı olarak, anatomik ve fizyolojik uzmanlıkların nörona özgü gelişimini incelemek ve işitsel beyin sapı gelişiminde iyi tanımlanmış zaman dilimlerinin kontrol edilmesine izin vermek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Drs'a teşekkür etmek isteriz. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria ve Bayan Ximena Optiz-Araya, protokol kurulumu ile ilk yardım için ve plazmid sağlamak için. Bu çalışma NIH / NIDCD hibe DC013841 (JTS) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C.
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M.
