Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques
Summary
Nous présentons une solution logicielle pour le suivi semi automatisé de la concentration relative de protéines sur toute la longueur des protrusions cellulaires dynamiques.
Abstract
Filopodia sont des protrusions cellulaires dynamiques, semblables à des doigts associées à la migration et à la communication cellule-cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes de signalisation complexes sous-jacents à l'initiation filopodiale, à l'allongement et à la stabilisation ou à la rétraction ultérieure, il est crucial de déterminer l'activité spatio-temporelle de la protéine dans ces structures dynamiques. Pour analyser la fonction des protéines dans filopodia, nous avons récemment développé un algorithme de suivi semi-automatisé qui s'adapte aux changements de forme filopodique, permettant ainsi une analyse parallèle de la dynamique de protrusion et de la concentration relative de protéines sur toute la longueur de la filopodie. Nous présentons ici un protocole détaillé étape par étape pour la gestion optimisée des cellules, l'acquisition d'images et l'analyse de logiciels. Nous fournissons également des instructions pour l'utilisation de fonctionnalités facultatives lors de l'analyse d'image et de la représentation des données, ainsi que des directives de dépannage pour toutes les étapes critiques en cours de route. Enfin, nous incluons également une comparaison de la dLogiciel d'analyse d'image écrited avec d'autres programmes disponibles pour la quantification de filopodia. Ensemble, le protocole présenté fournit un cadre pour une analyse précise de la dynamique des protéines dans les protubérances filopodiales à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image.
Introduction
Le contrôle spatio-temporel des protéines régulatrices d'actine est associé à la dynamique du filopodium 1 , 2 . Le suivi de la concentration de protéines spatialement résolue tout au long de la longueur filopodiale dans le temps est donc crucial pour faire progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'initiation, l'allongement, la stabilisation ou l'effondrement de ces structures dynamiques 3 , 4 . Contrairement à l'analyse des protéines dans le cytosol, où de nombreux changements de forme cellulaire se produisent à plus grande échelle, les filopodes sont des micro structures dynamiques qui bouclent constamment 5 et se courbent, ce qui exclut l'analyse en utilisant une approche simple telle qu'une analyse de ligne.
Différentes solutions logicielles pour le suivi de la forme filopodique sont disponibles 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, un logiciel pour le suivi ratitimétrique de la dynamique des protéines dans le corps cellulaire a été développé 10 , 11 . Pour combiner le suivi automatique de la forme filopodique et l'analyse spatio-temporelle des protéines, nous avons récemment développé un logiciel d'analyse d'image basé sur l'algorithme de la coque convexe 12 . Cette nouvelle méthode d'analyse, qui fonctionne via une interface utilisateur graphique (GUI), combine pour la première fois, la concentration relative de protéines le long de la longueur et de la vitesse de croissance filopodiales, permettant ainsi une mesure précise de la répartition spatio-temporelle des protéines indépendamment du mouvement de ces Structures dynamiques 12 .
L'idée derrière le logiciel (le code source est disponible gratuitement, voir ci-dessous) est que l'un des sommets de la coque convexe coïncide avec la pointe du filopodium ( Figure 1A ). En regardant dans le cadre ultérieur pourLe sommet le plus proche de la coque convexe, la pointe mobile peut être suivie tout au long du film. Une fois que la pointe est détectée dans chaque cadre, sa position est utilisée pour dessiner un axe en joignant la pointe avec un point de référence à la base du filopodium ( figure 1B ). Enfin, en utilisant des points nodaux équidistants, dont les positions sont déterminées par le pixel médian avec une intensité maximale le long de la ligne orthogonale à l'axe, sont utilisés pour déterminer un squelette qui suit la forme filopodique. Profitant de ce squelette adaptatif, un kymographe est généré pour tracer la croissance filopodiale et les concentrations de protéines pour jusqu'à trois canaux le long de la longueur filopodique ( figure 1C ).
Figure 1: Principe de fonctionnement du logiciel d'analyse d'image. ( A ) L'algorithme derrièreles logiciels. À l'étape 1, l'utilisateur spécifie la référence (base) et le sommet (la pointe) du filopodium. À l'étape 2-1, l'ossature du filopodium est obtenue en utilisant le pixel médian avec une valeur d'intensité maximale. À l'étape 3, l'ossature est utilisée pour le profil d'intensité de protéine spatiale. À l'étape 2-2, le logiciel suit automatiquement la pointe dans la trame suivante. La procédure entière itère. ( B ) Instantané de l'algorithme avec du filopodium réel présentant des éléments importants tels que la coque convexe qui est utilisée pour le suivi. ( C ) Vue d'ensemble des paramètres qui peuvent être mesurés avec l'algorithme. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 12 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Le logiciel d'analyse d'image est utilisé dans Matlab (appelé logiciel de programmation) par une utilisation graphiqueR interface. Pour maximiser la flexibilité et la robustesse pour le réglage expérimental particulier, l'utilisateur peut ajuster une série de paramètres de suivi ( p. Ex. Angle de flexion autorisé et mouvement entre images) et effectuer également des corrections aux films ( p. Ex., Recadrage, rotation, élimination des objets indésirables) ( Figure 2A et tableau 1) .
| GUI | Non. | Obligatoire | La description | Nom (en GUI) | ||||
| #1 | 1a | Y | Chargement du fichier .tiff empilé représentant le corps de la cellule (avec la case cochée) ou créez le corps cellulaire superposé à partir des canaux | Corps cellulaire | ||||
| #1 | 1b | Y | <td colspan="5"> Chargement d'un fichier d'image empilé correspondant à la protéine 1Protéines 1 | |||||
| #1 | 1c | Y | Chargement d'un fichier d'image empilé correspondant à la protéine 2 | Protéines 2 | ||||
| #1 | 1d | Y | Chargement du fichier d'image empilé correspondant à la protéine 3 | Protéines 3 | ||||
| #1 | 1e | N | Réinitialise tout à précharger les fichiers d'images empilés | Réinitialiser | ||||
| #1 | 2a | Y | Barre de défilement pour déterminer la trame initiale pour l'analyse dans la fenêtre GUI n ° 2 | N / A | ||||
| #1 | 2b | Y | Barre de défilement pour déterminer le cadre final pour l'analyse dans la fenêtre GUI n ° 2 | N / A | ||||
| #1 | 2c | Y | Barre de défilement représentant le curreCadre nt | N / A | ||||
| #1 | 2d | N | La valeur grise des pixels au-dessous de laquelle tous les pixels seront mis à zéro | N / A | ||||
| #1 | 2e | N | La valeur grise des pixels au-dessus de laquelle tous les pixels seront définis sur les valeurs maximales | N / A | ||||
| #1 | 2f | N | Définissez les valeurs d'intensité des pixels spécifiées par <2e> & <2f> | Ensemble | ||||
| #1 | 2 g | N | Jouez le film ajusté en intensité | Jouer | ||||
| #1 | 2h | N | Image de culture | Surgir | ||||
| #1 | 2i | N | Faire pivoter l'image | Tourner | ||||
| #1 | 2j | N | Supprimer les régions dans l'ensemble de la pile | Supprimer les régions | ||||
| #1 | 3a | Y | Cliquez pour ouvrir la «fenêtre d'analyse» (fenêtre GUI n ° 2) | Fenêtre de suivi | ||||
| #1 | 3b | Y | Entrez la taille d'un pixel en microns | Entrer la taille du pixel | ||||
| # 2 | 4 | Y | Cliquez pour générer l'image limite / bord du corps cellulaire superposé | Frontière | ||||
| # 2 | 5 | Y | Cliquez pour sélectionner la base et la pointe du filopodia | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | Y | Entrez le nombre de segments ou de nœuds | Nombre de segments | ||||
| # 2 | 6b | Y | Entrez la longueur de balayage (perpendiculaire à l'axe) | Largeur de numérisation | ||||
| # 2 | 6c | Y | Entrez la longueur au-dessus de laquelle filopodia commence à se pencher | Mes exacte après | ||||
| # 2 | 6d | Y | Entrez le rayon du cercle de détection de la pointe (c'est-à-dire la zone où le sommet peut être localisé dans la prochaine image) | Radius de détection de pointe | ||||
| # 2 | 6e | Y | Entrez l'angle maximum que le filopodium peut se pencher de l'axe vertical | Seuil d'angle | ||||
| # 2 | 6f | N | Ajouter des points de référence pour la base et la pointe pour ce cadre spécifique | Sélectionnez la référence | ||||
| # 2 | 6 g | N | Entrez la longueur au-dessus de laquelle filopodia commence à se plier pour ce cadre spécifique | Mes exacte après | ||||
| # 2 | <Td> 6hN | Entrez le rayon du cercle de détection pour ce cadre spécifique | Radius de détection de pointe | |||||
| # 2 | 6i | N | Après avoir entré tous les paramètres pour le cadre spécifique, cliquez pour enregistrer les valeurs dans la mémoire et le fichier pour plus d'informations. | Ajouter | ||||
| # 2 | 6j | N | Cliquez pour supprimer les paramètres manuellement définis pour cette image | Effacer | ||||
| # 2 | 6k | N | Cliquez pour supprimer tous les paramètres stockés manuellement à l'aide du «panneau des fonctions optionnelles» pour tous les cadres | Réinitialiser | ||||
| # 2 | 6l | N | Check in avant le suivi pour stocker tous les résultats de suivi en mémoire pour référence future | Histoire trace | ||||
| # 2 | 7 | Y | Cliquez pour commencer le suivi | Suivre et analyser | ||||
| # 2 | 8a | N | Cliquez pour commencer le suivi de l'intensité du canal protéique | Analyser les intensités de protéines | ||||
| # 2 | 8b | N | Check in pour suivre l'intensité du canal protéique le long de la longueur filopodiale | Filopodes entiers | ||||
| # 2 | 8c | N | Vérifier le suivi de la protéine de référence ou de la protéine A | ProteinA | ||||
| # 2 | 8d | N | Check in pour le suivi de la protéine B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | N | Check in pour le suivi de la protéine C | Protéines | ||||
| # 2 | 8f | N | Check in pour suivre l'intensité moyenne de la protéine dansE tip | Conseil principal | ||||
| # 2 | 8 g | N | Entrez la longueur de la pointe | Longueur des embouts | ||||
| # 2 | 8h | N | Entrez la distance minimale à partir de la base au-dessus de laquelle la pointe commence à former | seuil | ||||
| # 2 | 8i | N | Cliquez pour enregistrer les résultats de l'analyse de pointe avant de déposer | Bouton poussoir | ||||
| # 2 | 9a | N | Cliquez pour lancer l'analyse de la protéine ratiométrique | Comparer | ||||
| # 2 | 9b | N | Check in pour comparer la protéine B par rapport à A | Log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | N | Check in pour comparer la protéine C par rapport à A | Log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <Td> 9dN | Check in pour comparer la protéine B par rapport à A à la pointe | Log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | Check in pour comparer la protéine C par rapport à A à la pointe | Log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | N | Choisissez d'autres cartes de couleurs (par défaut: Jetplot) | Carte de couleur | ||||
| # 2 | 10b | N | Modifier la couleur | Modifier la couleur | ||||
Tableau 1: Vue d'ensemble de toutes les fonctions Présentes dans la GUI Windows n ° 1 et n ° 2.
Une fois que cela est accompli, le programme crée une coque convexe et suit automatiquement la pointe tout au long du film. Paramètres extraits du film, tels qu'un kymographe ratiométrique, une vitesse de croissance et une longueur filopodique aSont affichés et enregistrés dans le dossier de travail sous forme d'images et de fichiers de données. D'autres paramètres tels que la durée de vie filopodiale, le taux de croissance et le taux de retrait peuvent ensuite être extraits et analysés plus avant à partir des fichiers de données stockés ( Figure 2B ).
Figure 2: Interface utilisateur graphique pour l'utilisation du logiciel d'analyse d'image. ( A ) La fenêtre GUI # 1 est utilisée pour charger et traiter des images. Le programme peut charger jusqu'à 3 canaux de protéines, par lequel 2 canaux sont comparés par paire. La fenêtre est livrée avec des fonctions obligatoires (bleu) et optionnelles (vert) pour prétraiter les images avant le suivi ( B ). La fenêtre GUI # 2 est utilisée pour suivre l'analyse des protéines filopodium ainsi que spatio-temporelles et proportionnelles. Encore une fois, les fonctionnalités facultatives sont marquées en vert. Ce chiffre a été modifiDe la référence 12 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la préparation des échantillons et la gestion du logiciel. Nous commençons par des instructions détaillées sur la culture des cellules et l'acquisition de films optimisés pour l'analyse d'image. Cette section sur l'acquisition de données est suivie d'une description détaillée pour l'utilisation du logiciel d'analyse d'image. Tout au long du protocole, nous présentons des étapes critiques et des fonctionnalités facultatives qui devraient être prises en compte lors de la collecte et du traitement des données. Enfin, nous analysons filopodia à partir de différents modèles de systèmes avec le logiciel d'analyse d'image, avant de terminer avec une comparaison du logiciel d'analyse d'image décrit avec d'autres programmes disponibles pour la quantification filopodiale et une discussion sur les limites et les orientations futures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un protocole détaillé pour le suivi de la dynamique de croissance filopodiale et l'analyse des concentrations protéiques relatives dans ces structures dynamiques via l'algorithme de coque convexe. En utilisant le logiciel, jusqu'à 3 canaux peuvent être comparés par paire dans une seule opération, de sorte que les concentrations relatives de deux canaux ( c'est-à-dire les protéines) sont déterminées tout au long du cycle d'extension / rétractation et stockées…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le financement du DFG (EXC-1003 à MG).
Materials
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
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