Выделение мышиных полученных из жировой ткани микрососудистых Фрагментов как васкуляризация единицы для тканевой инженерии
Summary
Мы представляем протокол для выделения полученных из жировой ткани фрагменты микрососудистой, которые представляют собой перспективные единицы васкуляризации. Они могут быть быстро изолированы, не требуют обработки в лабораторных условиях и, таким образом, могут быть использованы для одностадийного prevascularization в различных областях тканевой инженерии.
Abstract
Функциональная сеть микрососудов имеет ключевое значение для выживания и интеграции инженерных конструкций ткани. Для этой цели были созданы несколько кровеносных сосудов и prevascularization стратегии. Тем не менее, большинство клеток на основе подходов включают в себя трудоемкую пробирке шагов для формирования сети микрососудов. Таким образом, они не пригодны для интраоперационных одношаговыми процедур. Полученных из жировой ткани микрососудистых фрагментов (Ad-MVF) представляют собой перспективные единицы васкуляризации. Они легко могут быть выделены из жировой ткани и обладают функциональной морфологии микрососудов. Кроме того, они быстро собрать в новые микрососудистых сети после имплантации в естественных условиях. Кроме того, объявление-MVF было показано, чтобы вызвать лимфангиогенез. И, наконец, они являются богатым источником мезенхимальных стволовых клеток, которые могут дополнительно способствовать их высокому потенциалу васкуляризации. В предыдущих исследованиях мы показали замечательную vascularizatiпо мощности ад-м.ф. в сконструированных костей и кожи заменителя. В настоящее исследовании мы сообщаем о стандартизированном протоколе для ферментативного выделения ад-м.ф. из мышиной жировой ткани.
Introduction
Тканевая инженерия фокусируется на изготовлении тканей и органов заменителей , которые поддерживают, восстанавливают или усиливают функцию неработоспособных в естественных условиях аналогов 1, 2. Судьба инженерных конструкций ткани в решающей степени зависит от адекватной васкуляризации 3. Микрососудистые сети внутри этих конструкций должны быть организованы иерархически , с артериол, капилляров и венул , чтобы обеспечить эффективное кровоснабжение после сращивания на сосудистую систему получателя 4. Поколение таких сетей является одной из ключевых проблем в тканевой инженерии. Для этого, широкий спектр экспериментальных стратегий васкуляризации было введено за последние два десятилетия 5, 6.
Ангиогенные подходы стимулируют прорастание микрососудов реципиентов в сконструированный TISSЕЭС посредством структурной модификации или физико – химической строительных лесов, таких как включение факторов роста 7. Тем не менее, для васкуляризации больших трехмерных конструкций, зависимого от ангиогенеза стратегия заметно ограничена медленными темпами роста развивающихся микрососудов 8.
В противоположность этому , понятие prevascularization стремится к генерации функциональных микрососудистых сетей в пределах ткани конструкций до их имплантации 9. Обычное prevascularization включает совместное культивирование сосудов , образующие клетки, такие как эндотелиальные клетки, Mural клетки или стволовые клетки 10, в пределах каркасов. После образования микрососудистой сети, то prevascularized конструкция может быть затем имплантирована в тканевые дефекты. Стоит отметить, что этот подход prevascularization трудно применять в клинических условиях, так как она основана на сложной и трудоемкой в пробирке </ EM> процедуры, которые ограничены основными регулирующими барьерами 9. Соответственно, все еще существует необходимость в разработке новых стратегий prevascularization, которые более пригодны для широкого клинического применения.
Такая стратегия prevascularization может быть применение полученных из жировой ткани микрососудистых фрагментов (Ad-MVF). ад-MVF представляют собой мощные васкуляризации единицы , которые могут быть собраны в больших количествах из жировой ткани крыс 11, 12 и 13 мышей. Они состоят из артериол, капилляром и венул сегментов сосудов, которые обладают физиологической морфологии микрососудов с просветом и стабилизирующих периваскулярных клеток 14, 15. Эта уникальная функция позволяет сразу же имплантацию рекламы MVF посеяны подмостей в тканевые дефекты без precultivation. Там, объявление-MVF быстро собрать вфункциональные микрососудистые сети. Кроме того, объявления-MVF представляет собой богатый источник мезенхимальных стволовых клеток 16, которые могут дополнительно способствовать их поразительной регенерационной способности. Соответственно, ад-MVF все шире используются в различных областях тканевой инженерии , 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
Изоляция ад-м.ф. первоначально была создана у крыс 11, 12. Здесь мы опишем протокол, который позволяет стандартизированную изоляцию мышиного ада-м.ф. из придатка жировых. Это может обеспечить более полное представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе функции ад-MVF с помощью трансгенных моделей мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы представляем устоявшийся протокол для выделения ад-м.ф.. Получение ад-MVF из мышиной жировой ткани является простой процедурой с нескольких важных шагов. Мыши проявляют различные подкожные и внутрибрюшные жировые отложения. Как было описано выше для крыс, наиболе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за отличную техническую помощь Джанин Беккера, Кэролайн Бикельманн и Рут Никелс. Это исследование финансировалось за счет гранта Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG – Немецкий фонд исследований) – LA 2682 / 7-1.
Materials
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
