Nous présentons un protocole pour isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux dérivé qui représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent être isolés rapidement, ne nécessitent pas dans le traitement in vitro et, par conséquent, peut être utilisé pour prévascularisation une étape dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire.
Un réseau microvasculaire fonctionnelle est d'une importance cruciale pour la survie et l'intégration des constructions de tissu d'ingénierie. A cet effet, plusieurs stratégies angiogéniques et prévascularisation ont été mis en place. Cependant, la plupart des approches basées sur les cellules comprennent chronophages étapes in vitro pour la formation d'un réseau microvasculaire. , Ils ne sont donc pas adaptés pour peropératoires procédures en une seule étape. fragments microvasculaires adipeuses dérivées de tissu (ad MVF) représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent facilement être isolées à partir de tissu adipeux et présentent une morphologie fonctionnelle microvaisseaux. De plus, ils réassembler rapidement dans de nouveaux réseaux microvasculaires après l' implantation in vivo. En outre, ad-MVF ont été montré pour induire lymphangiogenèse. Enfin, ils sont une riche source de cellules souches mésenchymateuses, qui peut en outre contribuer à leur fort potentiel de vascularisation. Dans des études précédentes, nous avons démontré la vascularizati remarquablesur la capacité d'ad-MVF dans l'os d'ingénierie et de substituts cutanés. Dans la présente étude, nous présentons un protocole standardisé pour l'isolement enzymatique ad-MVF de tissu adipeux de souris.
L' ingénierie tissulaire se concentre sur la fabrication de produits de remplacement de tissus et d' organes qui maintenir, rétablir ou d' augmenter la fonction des inopérable homologues in vivo 1, 2. Le sort des constructions de l' ingénierie tissulaire dépend essentiellement d' une vascularisation adéquate 3. Réseaux microvasculaires au sein de ces constructions doivent être organisés hiérarchiquement avec artérioles, capillaires et veinules pour permettre la perfusion sanguine efficace après anastomose à la vasculature du bénéficiaire 4. La génération de ces réseaux est parmi les principaux défis dans l'ingénierie tissulaire. A cet effet, un large éventail de stratégies de revascularisation expérimentales a été mis en place au cours des deux dernières décennies , 5, 6.
approches angiogéniques stimulent la croissance interne des microvaisseaux bénéficiaires dans Tiss d'ingénierieues par des moyens de modification de structure d'échafaudage ou physico – chimique, telles que l'incorporation de facteurs de croissance 7. Toutefois, pour les grandes constructions de vascularisation en trois dimensions, des stratégies dépendant de l' angiogenèse sont nettement limités par des taux de croissance lente de développement microvaisseaux 8.
Au contraire, le concept de prévascularisation vise pour la génération des réseaux microvasculaires fonctionnelles au sein des constructions de tissus avant leur implantation 9. Prévascularisation classique implique la co-culture de cellules de formation de vaisseaux, comme les cellules endothéliales, les cellules murales ou des cellules souches 10, à l' intérieur des échafaudages. Après la formation du réseau microvasculaire, les constructions prévascularisées peuvent alors être implantés dans des défauts du tissu. Il convient de noter, cette approche prévascularisation est difficile à appliquer dans un contexte clinique, car elle est basée sur in vitro complexe et prend du temps </ em> procédures, qui sont limitées par les principaux obstacles réglementaires 9. Par conséquent, il y a encore un besoin pour le développement de nouvelles stratégies de prévascularisation qui sont plus appropriés pour une large application clinique.
Une telle stratégie de prévascularisation peut être l'application des dérivées de tissu adipeux fragments microvasculaires (ad-MVF). ad-MVF représentent des unités de vascularisation puissants qui peuvent être récoltées en grandes quantités dans le tissu adipeux des rats 11, 12 et 13 les souris. Ils se composent d'artérioles, capillaires et veinules segments de vaisseaux, qui présentent une morphologie de microvaisseaux physiologique avec une lumière et de stabilisation des cellules périvasculaires 14, 15. Cette caractéristique unique permet l'implantation immédiate des échafauds ad MVF tête de série dans les défauts des tissus sans préculture. Là-bas, l'annonce-MVF réassembler rapidementà des réseaux microvasculaires fonctionnelles. Par ailleurs, ad-MVF représentent une riche source de cellules souches mésenchymateuses 16, ce qui peut contribuer en outre à leur capacité de régénération frappant. Par conséquent, ad-MVF sont de plus en plus utilisé dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
L'isolement de l' ad-MVF a été initialement mis en place chez les rats 11, 12. Nous décrivons ici un protocole qui permet l'isolement normalisé ad-MVF de souris à partir de tampons de graisse épididyme. Cela peut fournir de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents fonction ad-MVF en utilisant des modèles de souris transgéniques.
Dans cette étude, nous présentons un protocole bien établi pour l'isolement des ad-MVF. L'obtention ad-MVF du tissu adipeux de souris est une procédure simple avec quelques étapes critiques. Les souris présentent différents dépôts de graisse sous-cutanée et intra-abdominales. Comme précédemment décrit pour les rats, la source de matières grasses la plus appropriée pour l'isolement de l' ad-MVF sont les coussinets adipeux épididymaire en raison de leur taille, de structure homogène et une…
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants pour l'excellente assistance technique de Janine Becker, Caroline Bickelmann et Ruth Nickels. Cette étude a été financée par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG – Fondation allemande pour la recherche) – LA 2682 / 7-1.
1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |