組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離
Summary
我々は、有望な血管新生単位を表し、脂肪組織由来の微小血管断片を単離するためのプロトコルを提示します。それらはインビトロ処理に必要とせず、従って、組織工学の異なる分野でワンステップprevascularizationために使用することができる、迅速に分離することができます。
Abstract
機能的微小血管ネットワークは、改変された組織構築物の生存および統合のための極めて重要重要です。この目的のために、いくつかの血管新生およびprevascularization戦略が確立されています。しかし、ほとんどの細胞ベースのアプローチは、微小血管ネットワークの形成のために時間のかかるインビトロの工程を含みます。したがって、それらは手術ワンステップ手順には適していません。脂肪組織由来の微小血管フラグメント（AD-MVF）が有望な血管新生単位を表します。彼らは簡単に脂肪組織から単離され、機能的な微小血管の形態を示すことができます。また、彼らは急速にin vivoでの移植後の新しい微小血管のネットワークに組み立て直します。また、広告-MVFは、リンパ管新生を誘導することが示されています。最後に、彼らはさらに高い血管新生の可能性に寄与し得る間葉系幹細胞の豊富な源です。以前の研究では、我々は顕著vascularizatiを示しました設計骨や皮膚代替で広告-MVFの容量に。本研究では、我々は、マウスの脂肪組織からの広告-MVFの酵素を単離するための標準化されたプロトコルについて報告します。
Introduction
組織工学は、 インビボの対応1,2 に動作不能の機能を回復または増強、維持、組織および器官代替の製造に焦点を当てています。設計組織構築物の運命は決定的に十分な血管新生3に依存します。これらの構成要素内の微小血管ネットワークが階層的に受信者の血管系4にinosculation後の効率的な血液灌流を可能にするために動脈、毛細血管、および細静脈で整理する必要があります。このようなネットワークの生成は、組織工学における主要な課題の一つです。この目的のために、実験的な血管新生戦略の幅広いスペクトルは、最後の二十年5、6の上に導入されました。
血管新生のアプローチは、設計TISSに受信者の微小血管の成長を刺激しますそのような成長因子7の取り込みなどの構造的または物理化学的骨格修飾によりUEの、。しかし、大規模な3次元構造の血管新生のために、血管新生依存戦略が著しく微小血管8の開発の遅い成長速度によって制限されています。
組織内の機能微小血管ネットワークの世代が前に彼らの移植の9に構築するためにこれとは対照的に、prevascularizationの概念が目指しています。従来prevascularizationは、足場内の内皮細胞、壁画細胞または幹細胞10などの血管形成細胞の共培養を含みます。微小血管ネットワークを形成した後、prevascularized構築物はその後、組織欠損に移植することができます。それは複雑で時間のかかるインビトロに基づいているため、注目すべきは、このprevascularizationアプローチは、臨床現場で適用することは困難です</ em>の主要な規制のハードル9によって制限されている手順、。したがって、広範な臨床応用のために、より適している小説prevascularization戦略の開発の必要性が依然として存在しています。
そのようなprevascularization戦略は、脂肪組織由来の微小血管フラグメント（AD-MVF）のアプリケーションであってもよいです。 AD-MVFラット11、12及びマウス13の脂肪組織から大量に収穫することができる強力な血管新生単位を表します。彼らは細動脈、毛細管、及びルーメンと生理的な微小血管形態を示す細静脈血管セグメント、および安定血管周囲細胞14、15から成ります。このユニークな機能は、前培養することなく、組織欠損に広告-MVF-シードの足場の即時注入することができます。そこでは、広告-MVFは急速で組み立て直します機能的な微小血管ネットワークへ。また、AD-MVFは、さらにその打撃再生能力に寄与し得る間葉系幹細胞16の豊富な供給源を表します。したがって、AD-MVFはますます組織工学14、15、17、18、19、20、21の異なる分野で使用されています。
広告-MVFの単離は、もともとラット11、12に設立されました。ここで、我々は精巣上体脂肪パッドからマウス広告-MVFの標準化された単離を可能にするプロトコルを記述します。これは、トランスジェニックマウスモデルを使用して広告MVF機能の根底にある分子メカニズムさらなる洞察を提供することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、AD-MVFの単離のための十分に確立プロトコルを提示します。マウスの脂肪組織からの広告-MVFを取得することは、いくつかの重要なステップで簡単な手続きです。マウスは異なる皮下および腹腔内脂肪沈着を示します。以前にラットに関して記載したように、AD-MVFの単離のために最も適した脂肪源は、より大きな血管11との均質構造と最小限の汚染<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ジャニーン・ベッカー、キャロライン・ビッケルマンとルース・ニッケルズの優れた技術支援のために感謝しています。 （ – ドイツ研究協会DFG） – LA 2682 / 7-1この研究は、ドイツForschungsgemeinschaftの助成金によって賄われていました。
Materials
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
