Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

Summary

Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.

Abstract

Una red microvascular funcional es de importancia fundamental para la supervivencia y la integración de construcciones de tejido de ingeniería. Para este fin, se han establecido varias estrategias angiogénicos y prevascularization. Sin embargo, la mayoría de los enfoques basados en células incluyen pasos que consumen tiempo in vitro para la formación de una red microvascular. Por lo tanto, no son adecuados para los procedimientos de un solo paso intraoperatorias. fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo (AD-MVF) representan unidades de vascularización prometedores. Ellos pueden ser fácilmente aisladas de tejido graso y exhiben una morfología de microvasos funcional. Por otra parte, volver a montar rápidamente en nuevas redes microvasculares después de la implantación in vivo. Además, ad-MVF han demostrado inducir la linfangiogénesis. Por último, son una fuente rica de células madre mesenquimatosas, que pueden contribuir además a su alto potencial de la vascularización. En estudios previos se ha demostrado la notable vascularizatien la capacidad de ad-MVF en sustitutos de hueso y piel de ingeniería. En el presente estudio, se presenta en un protocolo estandarizado para el aislamiento enzimático de ad-MVF de tejido adiposo murino.

Introduction

La ingeniería de tejidos se centra en la fabricación de tejidos y órganos sustitutos que mantener, restaurar o aumentar la función de inoperable en homólogos in vivo ^{1, 2.} El destino de las construcciones de ingeniería tisular depende fundamentalmente de una vascularización adecuada ^3. Redes microvasculares dentro de estas construcciones deben ser organizados jerárquicamente con arteriolas, capilares y vénulas para permitir la perfusión de la sangre eficiente después de inosculation a la vasculatura ⁴ del destinatario. La generación de este tipo de redes es uno de los desafíos clave en la ingeniería de tejidos. Para este fin, un amplio espectro de estrategias de vascularización experimentales se ha introducido en las últimas dos décadas ^{5, 6.}

enfoques angiogénicos estimulan el crecimiento interno de microvasos los destinatarios de forma TISS ingenieríaues por medio de modificación andamiaje estructural o fisicoquímicas, tales como la incorporación de factores de crecimiento ^7. Sin embargo, para la vascularización de las grandes construcciones tridimensionales, las estrategias dependientes de la angiogénesis están marcadamente limitados por bajas tasas de crecimiento de desarrollo de microvasos ^8.

Por el contrario, el concepto de prevascularization apunta a la generación de redes microvasculares funcionales dentro del tejido construye antes de su implantación ^9. Prevascularization convencional implica el co-cultivo de células formadoras de vasos, tales como células endoteliales, células murales o células madre ^10, dentro de andamios. Después de la formación de la red microvascular, las construcciones prevascularizados entonces se pueden implantar en los defectos del tejido. Digno de mención, este enfoque prevascularization es difícil de aplicar en un entorno clínico, ya que se basa en la compleja y lenta in vitro </ em> los procedimientos que se encuentran restringidos por los principales obstáculos regulatorios ^9. En consecuencia, todavía hay una necesidad para el desarrollo de nuevas estrategias prevascularization que son más adecuados para una amplia aplicación clínica.

Tal estrategia prevascularization puede ser la aplicación de los fragmentos de microvasculares derivadas de tejido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representan unidades de vascularización potentes que pueden ser cosechados en grandes cantidades desde el tejido graso de ratas ^{11, 12} y ¹³ ratones. Se componen de arteriolar, capilar, y segmentos de vasos venulares, que exhiben una morfología de microvasos fisiológica con un lumen y la estabilización de células perivasculares ^{14, 15.} Esta característica única permite la implantación inmediata de andamios ad-MVF cabeza de serie en defectos de tejidos sin cultivo previo. Allí, el ad-MVF volver a montar rápidamente ena las redes microvasculares funcionales. Además, ad-MVF representan una fuente rica de células madre mesenquimales ^16, que pueden contribuir adicionalmente a su capacidad regenerativa llamativo. En consecuencia, ad-MVF se utilizan cada vez más en diferentes campos de la ingeniería de tejidos ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

El aislamiento de ad-MVF originalmente se ha establecido en ratas ^{11, 12.} En este documento, se describe un protocolo, que permite el aislamiento normalizado de murino ad-MVF de almohadillas de grasa del epidídimo. Esto puede proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la función ad-MVF mediante el uso de modelos de ratones transgénicos.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el uso de animales de experimentación y siguieron las directrices institucionales (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemania). 1. Preparación de instrumentos quirúrgicos Mantener listas las tijeras de disección, fórceps quirúrgicos, tijeras pequeñas de preparación, unas pinzas fi…

Representative Results

En el presente estudio hemos realizado seis procedimientos de aislamiento ad-MVF con el tejido de grasa de 7 a 12 meses de edad, de tipo salvaje macho C57BL / 6 ratones (peso corporal medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 ilustra la recolección de las almohadillas de grasa del epidídimo murino con posterior aislamiento mecánica y enzimática ad-MVF. El tiempo requerido para la recolección de grasa fue de 30 min y para el aislamiento de ad-MVF fue de 120 min. En total, el pr…

Discussion

En este estudio se presenta un protocolo bien establecido para el aislamiento de ad-MVF. La obtención de ad-MVF del tejido adiposo murino es un procedimiento sencillo con unos pocos pasos críticos. Ratones muestran diferentes subcutáneo y los depósitos de grasa intraabdominal. Como se ha descrito anteriormente para las ratas, la fuente de grasa más adecuado para el aislamiento de ad-MVF son las almohadillas de grasa del epidídimo debido a su tamaño, estructura homogénea y una contaminación mínima con los vasos…

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)