Isolering av Murine fettvev-avledet mikrovaskulær Fragmenter som vaskularisering Enheter for Tissue Engineering

Summary

Vi presenterer en protokoll for å isolere fettvevs-avledet mikrovaskulære fragmenter som representerer lovende vaskularisering enheter. De kan isoleres hurtig, ikke krever in vitro bearbeiding, og således kan anvendes for ett-trinns prevascularization innenfor forskjellige vev engineering.

Abstract

Et funksjonelt mikrovaskulær nettverk er av dreibar betydning for overlevelse og integrering av konstruerte vev konstruksjoner. For dette formålet, er det etablert flere angiogene og prevascularization strategier. Imidlertid er de fleste cellebaserte tilnærminger inkluderer tidkrevende in vitro fremgangsmåten for dannelse av en mikrovaskulær nettverk. Derfor, er de ikke egnet for intra ett-trinnsprosedyrer. Adipose tissue-avledet mikrovaskulære fragmenter (ad-MVF) representerer lovende vaskularisering enheter. De kan lett isoleres fra fettvevet og utviser en funksjonell microvessel morfologi. Videre må de raskt montere inn nye mikrovaskulære nettverk etter implantering in vivo. I tillegg har ad-MVF vist å indusere lymphangiogenesis. Til slutt, de er en rik kilde av mesenchymale stamceller, som ytterligere kan bidra til deres høye vaskularisering potensial. I tidligere studier har vi vist bemerkelsesverdig vascularizatipå kapasitet på ad-MVF i konstruerte bein og hud substitutter. I den foreliggende undersøkelse rapporterer vi på en standardisert protokoll for den enzymatiske isolering av ad-MVF fra murine fettvev.

Introduction

Tissue teknikk fokuserer på fremstilling av vevs- og organ substitutter som opprettholder, restaurere eller forsterke funksjonen av inoperable in vivo motstykker ^{1, 2.} Skjebnen av konstruerte vev konstruksjoner avgjørende avhengig av tilstrekkelig vaskularisering ^tre. Mikrovaskulære nettverk innen disse konstruksjonene bør hierarkisk organisert med arterioler, kapillærer og venules å tillate effektiv blod perfusjon etter inosculation til mottakerens blodkar ^4. Generering av slike nettverk er blant de viktigste utfordringene i tissue engineering. For dette formålet, har et bredt spekter av eksperimentelle vaskularisering strategier blitt introdusert i løpet av de siste to tiårene ^{5, 6.}

Angiogene tilnærminger stimulere innvekst av mottaker microvessels inn konstruert tissues ved hjelp av strukturell eller fysikalsk-kjemisk modifikasjon stillas, slik som inkorporering av vekstfaktorer ^{til 7.} Men for vaskularisering av store tredimensjonale konstruksjoner, angiogenese-avhengige strategier er markert begrenset av lave vekstrater for å utvikle microvessels ^8.

I motsetning til dette begrepet prevascularization mål for frembringelse av funksjonelle mikrovaskulære nettverk innen vev konstruerer før implantering ^9. Konvensjonell prevascularization omfatter ko-kulturen av fartøy-dannende celler, slik som endotelceller, celler eller vegg stamceller ^10, innen stillasene. Etter at mikrovaskulær nettverkdannelse, kan de prevascularized konstruksjonene deretter implanteres i vevsdefekter. Verdt å merke seg, er dette prevascularization tilnærmingen vanskelig å anvende i en klinisk setting, fordi den er basert på komplekse og tidkrevende in vitro </ em> prosedyrer, som er begrenset av store regulatoriske hindringer ^9. Følgelig er det fortsatt behov for utvikling av nye prevascularization strategier som er mer egnet for en bred klinisk anvendelse.

En slik strategi kan være prevascularization anvendelsen av adipose tissue-avledet mikrovaskulære fragmenter (ad-MVF). ad-MVF representere potent vaskularisering heter som kan høstes i store mengder fra fettvev hos rotter ^{11, 12} og ¹³ mus. De består av arteriolar, kapillær, og venular kar-segmenter, som oppviser en fysiologisk microvessel morfologi med en lumen og stabiliserende perivaskulære celler ^{14, 15.} Denne unike egenskap tillater den umiddelbare implantasjon av ad-MVF foret stillasene inn i vevsdefekter uten precultivation. Der ad-MVF raskt montere itil funksjonelle mikrovaskulære nettverk. Videre ad-MVF representere en rik kilde av stamceller ^16, som i tillegg kan bidra til deres slående evne til reproduksjon. Følgelig er ad-MVF stadig mer brukt i ulike områder av vevsteknologi ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

Isoleringen av ad-MVF har opprinnelig blitt fastslått i rotter ^{11, 12.} Heri beskriver vi en protokoll som gjør det mulig standardisert isolering av muse-ad-MVF fra epididymalvekt fett pads. Dette kan gi ytterligere innsikt i molekylære mekanismer som ligger til grunn ad-MVF funksjon ved anvendelse av transgene musemodeller.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i henhold til National Institute of Health retningslinjer for bruk av forsøksdyr og fulgt institusjonelle retningslinjer (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Tyskland). 1. Fremstilling av kirurgiske instrumenter Hold klar disseksjon saks, kirurgisk tang, små fremstillings saks, fin pinsett og en steril petriskål med 15 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DM…

Representative Results

I den foreliggende undersøkelse utført vi seks ad-MVF isoleringsprosedyrer med fettvev fra 7- til 12-måneder gamle hann villtype C57BL / 6-mus (gjennomsnittlig kroppsvekt: 35 ± 1 g). Figur 1 illustrerer den høsting av murine epididymal fettputer, med etterfølgende mekanisk og enzymatisk ad-MVF isolasjon. Den tid som er nødvendig for innhøsting av fett var 30 minutter og for isolering av ad-MVF var 120 min. Totalt ble prosedyren tok 150 min. <p class="jove_con…

Discussion

I denne studien presenterer vi en godt etablert protokoll for isolering av ad-MVF. Innhenting av ad-MVF fra murine fettvev er en enkel prosedyre med noen kritiske trinn. Mus som utviser forskjellig subkutan og intraabdominale fettdepoter. Som tidligere beskrevet for rotter, mest egnet fettkilde for isolering av ad-MVF er de epididymale fettputer på grunn av sin størrelse, homogen struktur og minimal forurensning med større blodkar ^{11, 12.} I motsetning til det…

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)