L'isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

Summary

Vi presentiamo un protocollo per isolare frammenti adiposo microvascolari derivate dal tessuto che rappresentano le unità di vascolarizzazione promettenti. Possono essere isolati rapidamente, non richiedono l'elaborazione in vitro e, pertanto, può essere utilizzato per un passo prevascularization in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti.

Abstract

Una rete microvascolare funzionale è di importanza fondamentale per la sopravvivenza e l'integrazione dei costrutti ingegneria tessutale. A questo scopo, sono state stabilite diverse strategie angiogenici e prevascularization. Tuttavia, la maggior parte degli approcci basati su celle includono passi in termini di tempo in vitro per la formazione di una rete microvascolare. Quindi, essi non sono adatti per intraoperatori procedure one-step. Adiposo derivate dal tessuto frammenti microvascolari (ad-MVF) rappresentano le unità vascolarizzazione promettenti. Essi possono essere facilmente isolati dal tessuto grasso e presentano una morfologia microvasi funzionale. Inoltre, essi rapidamente rimontare in nuove reti microvascolari dopo l'impianto in vivo. Inoltre, ad-DMV hanno dimostrato di indurre linfangiogenesi. Infine, sono una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali, che possono ulteriormente contribuire alla loro elevato potenziale di vascolarizzazione. In studi precedenti abbiamo dimostrato la notevole vascularizatisulla capacità di ad-MVF in sostituti ossei e cutanei ingegnerizzati. Nel presente studio, riportiamo un protocollo standardizzato per l'isolamento enzimatica di ad-DMV da tessuto adiposo murino.

Introduction

Ingegneria tissutale si concentra sulla fabbricazione di tessuti e organi succedanei mantenere, ripristinare o aumentare la funzione di inutilizzabile in vivo controparti ^{1, 2.} Il destino di costrutti di tessuto ingegnerizzati dipende essenzialmente una vascolarizzazione adeguata ^3. Reti microvascolari all'interno di questi costrutti dovrebbero essere organizzati gerarchicamente con arteriole, capillari e venule per consentire efficiente perfusione sanguigna dopo inosculation alla vascolarizzazione del destinatario ^4. La generazione di queste reti è tra le principali sfide nel campo dell'ingegneria dei tessuti. A tale scopo, un ampio spettro di strategie di vascolarizzazione sperimentali è stata introdotta nel corso degli ultimi due decenni ^{5, 6.}

approcci angiogenici stimolano la crescita interna dei microvasi dei destinatari nel tiss ingegnerizzatiues mediante modificazione ponteggio strutturale o fisico-chimiche, come ad esempio l'incorporazione di fattori di crescita ^7. Tuttavia, per la vascolarizzazione di grandi costrutti tridimensionali, le strategie di angiogenesi-dipendenti sono notevolmente limitate da tassi di crescita lenta di sviluppo di microvasi ^8.

Al contrario, il concetto di prevascularization mira per la generazione di reti microvascolari funzionali all'interno del tessuto costruisce prima del loro impianto ^9. Prevascularization convenzionale comporta la co-coltura delle cellule del vaso che formano, come le cellule endoteliali, cellule murali o cellule staminali ^10, all'interno ponteggi. Dopo la formazione della rete microvascolare, i costrutti prevascularized possono essere impiantati in difetti del tessuto. Degno di nota, questo approccio prevascularization è di difficile applicazione in un ambiente clinico, perché si basa sulla complessa e richiede molto tempo in vitro </ em> le procedure, che sono limitati dai maggiori ostacoli normativi ^9. Di conseguenza, v'è ancora una necessità per lo sviluppo di strategie prevascularization nuovi che sono più adatti per un'ampia applicazione clinica.

Tale strategia prevascularization può essere l'applicazione di frammenti di tessuto adiposo derivate microvascolari (ad-MVF). ad-MVF rappresentano le unità di vascolarizzazione potenti che possono essere raccolti in grandi quantità dal tessuto adiposo dei ratti ^{11, 12} e ¹³ topi. Sono costituiti da arteriolare, capillare e segmenti di flotta venulari, che presentano una morfologia microrecipiente fisiologico con un lume e stabilizzanti cellule perivascolari ^{14, 15.} Questa caratteristica unica permette l'inserimento immediato di ponteggi ad-MVF-seminato in difetti del tessuto, senza precoltura. C'è, l'annuncio-DMV rapidamente rimontare inalle reti microvascolari funzionali. Inoltre, ad-DMV rappresentano una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali ^16, che possono inoltre contribuire alla loro capacità rigenerativa sorprendente. Di conseguenza, ad-DMV sono sempre più utilizzati in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

L'isolamento di ad-DMV è stato originariamente istituito nel ratti ^{11, 12.} Qui, descriviamo un protocollo, che permette l'isolamento standardizzato di murino ad-DMV da cuscinetti di grasso dell'epididimo. Ciò può fornire ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari alla base della funzione ad-DMV utilizzando modelli di topi transgenici.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite secondo l'Istituto Nazionale di Salute linee guida per l'uso di animali da laboratorio e hanno seguito le linee guida istituzionali (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und di veterinaria, Zentralstelle, Saarbrücken, Germania). 1. Preparazione di strumenti chirurgici Tenere pronte le forbici dissezione, pinze chirurgiche, forbici preparazione piccole pinza sottile e una piastra di Petri steri…

Representative Results

Nel presente studio abbiamo eseguito sei procedure di isolamento ad-MVF con il tessuto grasso da 7 a 12 mesi maschio wild-type C57BL 6 topi / (peso corporeo medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 illustra la raccolta dei cuscinetti adiposi dell'epididimo murini con conseguente isolamento meccanico ed enzimatica ad-DMV. Il tempo necessario per la raccolta di grasso era 30 minuti e per l'isolamento di ad-DMV era di 120 min. In totale, la procedura ha avuto 150 min. <p …

Discussion

In questo studio vi presentiamo un protocollo consolidata per l'isolamento di ad-MVF. Ottenere ad-MVF dal tessuto adiposo murino è una procedura semplice con pochi passaggi critici. I topi mostrano sottocutaneo diverso e depositi di grasso intra-addominale. Come precedentemente descritto per ratti, la fonte di grassi più adatto per l'isolamento di annuncio-DMV sono i cuscinetti adiposi dell'epididimo causa delle loro dimensioni, struttura omogenea e poco contaminate con vasi sanguigni più grandi <sup clas…

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)