ここで我々 はマイクロ Rna 組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用して神経筋疾患のマウスモデルでの配信をについて説明します。単一の末梢投与マウスにおける筋と運動ニューロン、miRNA の機能を検討し、治療の潜在的なin vivoする機会を提供することで持続的な miRNA 発現となりました。
内因性マイクロ Rna 経路を介した RNA 干渉は、転写後の遺伝子サイレンシングによってタンパク質合成を制御することにより遺伝子発現を調節します。近年、マイクロ Rna を介した遺伝子発現制御有毒な利得関数メカニズムによって引き起こされる神経学的疾患の治療の可能性を示しました。ただし、標的組織への効率的な配信は、そのアプリケーションを制限されています。ここでは、脊髄や延髄筋萎縮症 (SBMA) のトランスジェニック マウス モデルを使用、神経筋疾患ポリグルタミンの膨張によるアンドロゲン受容体 (AR) による遺伝子サイレンシングをテストするために新たな識別された AR ターゲット miRNA、ミール 298。我々 はミール 298 組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 血清型 9 ベクトルを使用して、非分裂細胞の情報伝達を容易に過剰発現。SBMA マウスの尾静脈注射は骨格筋と運動ニューロンのミール-298 の持続的かつ広範な発現を誘導し、マウスの神経の表現型の改善で起因しました。
Mirna が非コード Rna が、遺伝子発現制御、多様な細胞と代謝経路の調節に重要な役割を果たしている、長さ 21 23 ヌクレオチド。1遺伝子発現は転写後の遺伝子サイレンシングまたは mRNA の分解を誘導することによって調整される主に。2 MiRNAs は通常、3′ 非翻訳領域 (UTR) 連結 5′ UTR の遺伝子のコーディングおよびコーディングの mRNA も記載されているターゲットの領域を補完するものです。3
ひと疾患の病態におけるマイクロ Rna の役割の現在の理解の拡大、個々 の miRNAs の miRNA 家族薬理学的変調には有効な治療選択肢、ますます。MiRNAs その他の RNA 阻害戦略と比較して、多くの利点があります: miRNAs は毒性が少ないと低い免疫原性とサイズが小さいセルに簡単に配信することができます。4,5,6 MiRNAs 通常ある携帯電話ネットワーク内に多くのターゲットしたがって潜在的なターゲットに効果と安全性の懸念を標的組織への効率的な配信を指定のアカウントに入れる必要があります。
神経筋疾患は、集録または筋肉と運動ニューロンに影響を与える条件を継承します。骨格筋への薬物の対象と研究、主な課題は、治療ウィンドウ内の広範な分布を達成するためにはどこの新興エリアです。7運動ニューロンは、血液脳関門によって薬へのアクセスを妨げないために主に対象とするより困難。
脊髄と延髄筋萎縮症 (SBMA) の細胞培養とねずみのモデルは、この研究で使用されました。SBMA は有毒な利得筋と運動ニューロンの両方が影響を受ける関数メカニズムによって引き起こされる神経筋疾患です。8,9 SBMA (ケネディの病気;OMIM #313200) は X リンク疾患、筋肉の脱力が特徴と萎縮、エンコードAR蛋白質拡張 2p018 AR 遺伝子 CAG リピート拡大によって引き起こされます。10この無秩序のため現在入手可能な病気変更の処置はありません。本研究で用いたトランスジェニック マウス モデルを繰り返す男女の特異性、運動ニューロンの病理、進行性筋萎縮症など、病気の特徴。11
本研究で我々 の努力は miRNA を識別するのに焦点を当てて直接下方制御式変異 AR 遺伝子と脊髄に miRNA の配信と私たちの病気のマウスモデルの骨格筋の安全かつ効率的なモードを設計します。
ここで我々 は比較的メタボライト miRNA、miRNA-298 (加入番号 MIMAT0004901)、SBMA モデルにおける変異 AR 表現を直接抑える12特定。ミール 298 の標的組織への配信を達成するために、組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 (rAAV9) ウイルス戦略を使いました。rAAV9 は、血液脳関門を通過し、非分裂細胞、ニューロンを含む長期の遺伝子発現を仲介することが可能です。13 AAV9-ミール-298 の単一の全身投与は miRNA、筋肉と運動ニューロンの効率的な伝達、AR 発現のダウンレギュレーション、SBMA のマウスの病気の表現型の改善の持続的な表現になった14 miRNA antagomirs 過剰発現または生体内で提供するためにこの手法を使用できます。
ここで選択して配送尾注入を介してウイルスのベクトルとして rAAV9 を使用して、骨格筋およびマウスの運動ニューロンを対象に miRNA の非常に効率的かつアクセス可能な方法論を示します。14に比べて他の RNAi の戦略、Mirna、毒性が少ないと少ない免疫原性。18また、サイズが小さいウイルスのベクトルの限られた包装の容量に適したそれらを作る。2計算アルゴリズムと予測ツールと推定されるマイクロ Rna mRNA ターゲットの同定ができます。識別されると、miRNA のターゲット遺伝子発現に及ぼす影響を確認する必要があります。一般的なアプローチは、与えられた miRNAの in vitroノザン西部分析を用いたターゲット バイオマーカ発現量を検出しです。14,19
様々 な研究は、Mirna を提供するため、ウイルス ・非ウイルスベクターの戦略を使用しています。13ここでは、遺伝子の配信ツールとしてアデノ随伴ウイルス (AAV) を使用しました。分割で親和性の広範なスペクトルで、長期的な遺伝子導入により、他のウイルスのベクトルと比較して、AAV を引き出す低免疫原性、および非分裂細胞。18この配信方法も機能性と RNA 分子の特異性に影響を与える可能性があります化学修飾の必要性を回避できます。AAV のキャプシド蛋白質の組成によってほとんど決定されているいくつかの血清型があります。これらの血清型の親和性が異なるし、異なる種類の細胞を変換します。標的組織を考慮したときに正しい型を選択する必要があります。我々 は中枢神経系、骨格筋周辺管理19、20次にその高い伝達効率のための rAAV9 を選択します。このアプローチは、大人動物、細胞外マトリックスの組成、ニューロン-グリア比、血液脳関門の成熟度の違いによる可能性が高いと比較して新生児の動物の伝達効果を示しています。21,22
このプロトコルの重要なステップは、発現ベクターのデザインです。低いプロモーターの横にある最初の遺伝子と比較して 2 番目の遺伝子発現が妨げになって、bicistronic のベクトルと比較してデュアル プロモーター ベクトルにより従って miRNA、EGFP の発現を降伏バックツー バック構成蛍光抗体法によるマウス組織における miRNA の局在化を許可します。
AAV9 の静脈内注射は、高効率と標的組織、骨格筋運動ニューロンで均質な伝達で起因しました。インジェクションのこのルートでは、全身循環に到達し、中枢神経系治療に重要な脳血液関門を横断する投与量をことができます。さらに、中枢神経系への配信のための非侵襲的な方法です。ミール 298 式は 5 週齢で単一の末梢注入で 2-4 週間後脊髄、筋肉増加。とき遅延伝達を説明するかもしれない単一座礁させたゲノム AAV のベクトルを 2 番目の DNA 鎖のデノボ合成を使用しています。23
人間のミール-298 のレベル検出されなかった投与で慢性疾患の複数の注射が治療効果に到達するために必要なことを示唆して、単回投与後 20 週。ただし、経時劣化も miRNA を制限して、生涯の反復投与が必要な場合があります。さらに、AAV のベクトルへの適応免疫は、巧妙な遺伝子配達に別の障壁を形成できます。24免疫不活性 AAV ベクターのように世代は反復投与とこの有望な配信システムで長期的な効果を達成するために重要です。25
治療戦略として miRNA の使用に関する制限は、オフターゲット効果のリスクです。MiRNAs は可能性がありますこのアプローチで安全上のリスクをもたらす、incomplementary 他の遺伝子の転写を基礎に組み合わせるを通じてやり取りします。マイクロ プロセッサ複合体をバイパスする、広範な長期的な安全性と忍容性の研究は、この戦略を安全に変換する前に重要、mirtrons など、非正規の miRNAs の使用を含む、RNAi シーケンスの設計を改善し、有効な治療法です。26,27,28
MiRNA の発現として開発されたここで説明した方法が、miRNA 阻害療法 antagomirs を使用して活用することができますではも。
The authors have nothing to disclose.
著者は利益相反を宣言しません。AAV9 ウイルス産生ありがとう SignaGen 研究所 (Rockvile、MD、米国)。この研究は、NINDS、NIH の学内研究プログラムによって支えられました。フィリップ r. リーは、NICHD 学内研究部門からの資金によって支えられました。カルロ ・ リナルディは、協会フランセーズ contre レ Myopathies (AFM) から奨学金によって支えられました。
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |