Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.
RNA-Interferenz über den endogenen MiRNA Weg regelt Genexpression durch die Kontrolle der Proteinsynthese durch posttranskriptionelle gen-silencing. In den letzten Jahren hat die MiRNA-vermittelten Genregulation Potenzial für die Behandlung von neurologischen Störungen, verursacht durch einen giftigen Gewinn der Funktion Mechanismus gezeigt. Effiziente Bereitstellung zum Zielgewebe sind jedoch seine Anwendung begrenzt. Hier haben wir einem transgenen Mausmodell für bulbärer und Spinale Muskelatrophie (SBMA) verwendet, eine Neuromuskuläre Krankheit verursacht durch Trinukleotiderkrankungen Expansion in den Androgenrezeptor (AR), testen Sie gen-silencing durch eine neu identifizierten AR-targeting MiRNA, MiR-298. Wir überexprimiert MiR-298 mit einem rekombinanten Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Serotyp 9 Vektor Transduktion von nicht-teilenden Zellen zu erleichtern. Eine einzige Rute-Vene-Injektion bei SBMA Mäusen induziert nachhaltig und weit verbreitete Überexpression von MiR-298 im Skelettmuskel und motorischen Neuronen und führte zu Verbesserung der neuromuskulären Phänotyp in den Mäusen.
MiRNAs sind nicht-RNAs, 21-23 Nukleotide in der Länge, Codierung, die eine wichtige bei der Regulation der Genexpression und Kontrolle der verschiedenen zellulären und metabolische Bahnen Rolle. 1 Genexpression wird hauptsächlich durch Induktion posttranskriptionelle gen zum Schweigen zu bringen oder mRNA Abbau reguliert. 2 MiRNAs ergänzen sich in der Regel um die 3′ untranslatierten Region (UTR) Kodierung Gene, obwohl binden an den 5′ UTR und Codierung Regionen des Ziels, die mRNA auch beschrieben worden ist. 3
Das gegenwärtige Verständnis der Rollen von MiRNA in der Pathogenese von Krankheiten des Menschen dehnt sich aus, wird pharmakologische Modulation der einzelnen MiRNAs oder MiRNA-Familien zunehmend eine sinnvolle therapeutische Option. Im Vergleich zu anderen RNA Hemmung Strategien, MiRNAs haben viele Vorteile: MiRNAs sind weniger toxisch und weniger immunogen und können leicht in Zellen aufgrund ihrer geringen Größe geliefert werden. 4 , 5 , 6 MiRNAs haben in der Regel viele Ziele innerhalb von Mobilfunknetzen, daher mögliche Ziel-Effekte und Sicherheitsbedenken müssen berücksichtigt werden, zusammen mit effizienten Auslieferung an Zielgeweben.
Neuromuskuläre Erkrankungen sind erworben oder geerbt Bedingungen, die Muskel- und motorischen Neuronen beeinflussen. Die Ausrichtung der Drogen in Skelettmuskeln ist eine aufstrebende Gebiet der Forschung, wo die größte Herausforderung ist, weite Verbreitung innerhalb des therapeutischen Fensters zu erreichen. 7 Motoneuronen sind schwieriger zu Zielen, vor allem, weil Zugang zu Medikamenten, durch die Blut-Hirn-Schranke verwehrt ist.
Kultur und Maus zellmodelle bulbärer und Spinale Muskelatrophie (SBMA) wurden in dieser Studie verwendet. SBMA ist eine neuromuskuläre Erkrankung, verursacht durch einen giftigen Gewinn Funktion Mechanismus, in dem Muskel und motorischen Neuronen betroffen sind. 8 , 9 SBMA (Kennedy-Krankheit; OMIM #313200) ist eine X-chromosomale Krankheit, gekennzeichnet durch Muskelschwäche und Atrophie, verursacht durch CAG Wiederholung Expansion in das AR-gen, das eine erweiterte Trinukleotiderkrankungen-Darm-Trakt in der AR -Protein kodiert. 10 keine krankheitsmodifizierende Therapie ist derzeit verfügbar für diese Störung. In dieser Studie verwendeten transgenen Mausmodell rekapituliert die Merkmale der Krankheit, einschließlich Geschlecht Spezifität, Motoneuron Pathologie und progressive Muskelatrophie. 11
In dieser Studie, unser konzentriert auf die Ermittlung eines MiRNA, die direkt herunterreguliert Ausdruck der mutierten AR Transgen und auf eine sichere und effiziente Art der Lieferung von MiRNA zum Rückenmark und Skelettmuskulatur von unserer Krankheit-Maus-Modell entwerfen.
Hier haben wir eine relativ fußgelenkes MiRNA, MiRNA-298 (Zbl-Nummer MIMAT0004901),12 , mutierte AR Ausdruck in SBMA Modellen direkt zu reduzieren. Um Lieferung von MiR-298 an Zielgeweben zu erreichen, verwenden wir eine virale Strategie mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 (rAAV9). rAAV9 ist in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke und langfristige Genexpression in nicht-teilenden Zellen, einschließlich Neuronen zu vermitteln. 13 eine einzelne systemische Verabreichung von AAV9-MiR-298 führte zu nachhaltigen Ausdruck der MiRNA, effizienten Transduktion von Muskel- und motorischen Neuronen, Down-Regulierung der AR Ausdruck und Besserung der Krankheit Phänotyp bei SBMA Mäusen. 14 dieser Methodik lässt sich MiRNA oder antagomire Überexpression in Vivozu bieten.
Hier zeigen wir eine hocheffiziente und zugänglich Methodik um auszuwählen und liefern über Heck Injektion eine MiRNA mit rAAV9 als viraler Vektor Skelettmuskulatur und motorischen Neuronen in den Mäusen. 14 im Vergleich zu anderen RNAi-Strategien, sind MiRNAs weniger giftig und weniger immunogen. 18 darüber hinaus ihre geringe Größe machen sie gut geeignet, um die begrenzten Verpackungskapazität von viralen Vektoren. 2 numerische Algorithmen und Vorhersage Werkzeuge ermöglichen die Identifizierung von vermeintlichen MiRNA-mRNA Zielen. Einmal identifiziert, müssen die Auswirkungen der MiRNA auf Ziel Genexpression nachgewiesen werden. Ein gemeinsamer Ansatz ist einer bestimmten MiRNA in Vitro overexpress und Protein Ausdruck Zielwerte mit westlichen Analyse zu erkennen. 14 , 19
Verschiedene Studien haben virale und nicht-viralen Strategien verwendet, für die Bereitstellung von MiRNAs. 13 hier wir Adeno-assoziierte Virus (AAV) als gen Lieferung-Tool verwendet. Im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, AAV entlockt niedrige Immunogenität ermöglicht langfristige Gentransfer, und hat ein breites Spektrum an Tropismus zu Spalten und nicht-teilenden Zellen. 18 diese Versandart kann auch die Notwendigkeit einer chemischen Veränderung umgehen, die Funktionalität und die Spezifität der RNS-Molekül beeinträchtigen können. Es gibt mehrere Serotypen der AAV, die meist durch die Zusammensetzung der Kapsid-Proteine bestimmt werden. Diese Serotypen unterscheiden sich in ihren Tropismus und transduzieren verschiedener Zelltypen. Es ist notwendig, die korrekte Serotyp auszuwählen, wenn man bedenkt das Zielgewebe. Wir haben rAAV9, aufgrund seiner hohen Transduktion Effizienz in das zentrale Nervensystem und Skelettmuskulatur nach peripheren Verwaltung19,20. Dieser Ansatz hat größere Transduktion Wirksamkeit bei Neugeborenen Tieren im Vergleich zu erwachsenen Tieren, wahrscheinlich wegen der Unterschiede in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, Neuron-Glia-Verhältnis und Reife der Blut-Hirn-Schranke gezeigt. 21 , 22
Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist das Design des Expressionsvektors. Im Vergleich zu Bicistronic Vektoren, die durch niedrigere Ausdruck des zweiten Gens im Vergleich mit dem ersten Gen neben der Projektträger behindert sind, ermöglicht der dual Promotor Vektor eine kaskadierende Konfiguration so hohe Expression der MiRNA und EGFP, nachgeben Lokalisierung von der MiRNA ermöglicht im Maus-Gewebe durch Immunfluoreszenz.
Intravenöser Injektion von AAV9 führte zu hohen Wirkungsgrad und homogene Transduktion in den Zielgeweben, Skelettmuskel und motorischen Neuronen. Diese Route der Injektion ermöglicht der verabreichte Dosis zu erreichen die systemische Zirkulation und Hirn-Schranke das Blut, das für Therapien, die auf das zentrale Nervensystem wichtig ist. Darüber hinaus ist es eine nicht-invasive Methode zur Auslieferung an die CNS. MiR-298 Ausdruck erhöht in das Rückenmark und Muskel nach 2-4 Wochen mit einer einzigen peripheren Injektion bei 5 Wochen alt. Wenn mit einsträngiger Genom AAV Vektoren, die de-Novo -Synthese des zweiten DNA-Strang für die verzögerte Transduktion ausmachen können. 23
Ebenen der menschlichen MiR-298 waren nicht nachweisbar im behandelten Mäuse 20 Wochen nach einer einzigen Verwaltung, darauf hindeutet, dass bei chronischen Erkrankungen, mehrere Injektionen erforderlich, um einen therapeutischen Nutzen zu erreichen. Jedoch kann die MiRNA Verschlechterung im Laufe der Zeit Begrenzung wenn ein lebenslange wiederholter Verabreichung erforderlich ist. Darüber hinaus kann adaptive Immunität gegen AAV-Vektoren ein weiteres Hindernis für eine erfolgreiche gen-Lieferung bilden. 24 so Generation der AAV-Vektoren, die immunologisch inerten ist entscheidend für wiederholter Verabreichung und langfristige Effekte mit diesem vielversprechenden-Delivery-System zu erreichen. 25
Eine Beschränkung auf die Verwendung von MiRNA als therapeutische Strategie ist das Risiko von Ziel-Effekten. MiRNAs können durch incomplementary Basenpaarung mit anderen gen-Transkripte, die eine Sicherheit Gefahr mit diesem Ansatz interagieren. Verbesserte Gestaltung der RNAi-Sequenzen, einschließlich der Verwendung von nicht-kanonischen MiRNAs, z. B. Mirtrons, das umgehen des Mikroprozessor-komplexes und umfangreiche Sicherheits- und Verträglichkeitsprofil Langzeitstudien kritisieren vor der Umsetzung dieser Strategie in eine sichere und effektive Therapie. 26 , 27 , 28
Die hier beschriebene Methode wurde ursprünglich für MiRNA Überexpression entwickelt, aber es kann auch für MiRNA Hemmung Therapie mit antagomire genutzt werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt. Wir danken SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) für das AAV9-Virus-Produktion. Diese Forschung wurde durch das intramurale Forschungsprogramm der NINDS, NIH unterstützt. Philip R. Lee wurde aus der Division von intramuralen Forschung NICHD Mitteln unterstützt. Carlo Rinaldi wurde durch ein Stipendium von der Association Française Contre Les Myopathien (AFM) unterstützt.
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |