Summary
यहां, हम वयस्क चूहों से सक्षम वेंट्रिकुलर स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं और तेज इलेक्ट्रोड एक्शन संभावित रिकॉर्डिंग के लिए उनका उपयोग करते हैं। इन बहुकोशिकीय तैयारी ऊतक संरचना की तरह विवो में एक संरक्षित प्रदान करते हैं, जो उन्हें इन विट्रो में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और औषधीय अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाता है।
Abstract
मरीन कार्डिओमोओसाइट्स को हृदय क्रिया विज्ञान के विट्रो अध्ययन और नई चिकित्सीय रणनीतियों के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। हालांकि, अलग-अलग कार्डियोमोओसाइट्स की बहुकोशिकीय तैयारी कार्डियोमायोसाइट्स, गैर-मैकोसाइट्स और बाह्य मैट्रिक्स के विवो संरचना में परिसर का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, जो हृदय के दोनों यांत्रिक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को प्रभावित करती है। यहां हम एक तंत्र का वर्णन करते हैं जो ऊतक संरचना जैसे विवो में संरक्षित साथ वयस्क माउस के दिलों के व्यवहार्य निलय के स्लाइस तैयार करने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उनकी उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं। दिल की छांटना के बाद, वेन्ट्रिकल्स एट्रिया से अलग हो जाते हैं, जिसमें Ca 2 + -free समाधान होता है जिसमें 2,3-ब्यूटेनडीओन मोनोऑक्ज़ेम होता है और 4% कम पिघला हुआ एगरोस ब्लॉक में एम्बेडेड होता है। ब्लॉक को एक हिलिंग ब्लेड के साथ एक माइक्रोोटिम पर रखा गया है, और 150-400 माइक्रोन की मोटाई के साथ ऊतक के स्लाइस कंपन फ्रेडर को तैयार किए जाते हैं।60-70 हर्ट्ज पर ब्लेड की समाप्ति और ब्लेड को आगे बढ़ने से धीरे-धीरे आगे बढ़ना स्लाइस की मोटाई आगे के आवेदन पर निर्भर करती है। स्लाइस बर्फ ठंड टरोड के समाधान में 0.9 मिमी सीए 2 + और 2 3-ब्यूटेनएडीओन मॉन्क्ऑक्सियम (बीडीएम) के 30 मिनट के लिए संग्रहीत होते हैं। इसके बाद, स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस डीएमईएम को 30 मिनट के लिए स्थानांतरित किया जाता है ताकि बीडीएम को धोया जा सके। सिकुड़ाए कार्य का विश्लेषण करने या प्रत्यारोपित स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोयोमोसाइट्स और होस्ट टिशू के संपर्क की जांच करने के लिए बल माप के लिए, स्लाइस का उपयोग तीव्र इलेक्ट्रोड या माइक्रो इलेक्ट्रोड एरेज़ के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए किया जा सकता है। तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए, एक औंधा माइक्रोस्कोप के ताप प्लेट पर 3 सेमी सेल कल्चर डिश में एक टुकड़ा रखा गया है। एक एकध्रुवीय इलेक्ट्रोड के साथ टुकड़ा को प्रेरित किया जाता है, और टुकड़ों के भीतर कार्डियोमोसाइट्स के अंतःक्रियात्मक एक्शन क्षमताएं तेज कांच इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज की जाती हैं।
Introduction
यममोट और एमक्लवेन से पता चला कि 1 9 66 में मस्तिष्क के स्लाइस की बिजली की गतिविधि इन विट्रो 1 में बनाए रखी गई थी, क्योंकि मूल विज्ञान में पतली टिशू स्लाइस का प्रयोग अक्सर किया जाता है। तब से, मस्तिष्क 2 , यकृत 3 , फेफड़े 4 और मैकार्डियल टिशू 5 , 6 , 7 से स्लाइस पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और औषधीय अध्ययन किए गए हैं। नवजात शिशु के हृदय से वेंट्रिकुलर स्लाइस में पहला पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग 1 9 8 8 में वर्णित है, लेकिन यह तकनीक कुछ समय के लिए विस्मृति में गिर गई। एक दशक से भी अधिक समय तक, हमारे समूह ने म्यूरीन भ्रूणीय 9 , नवजात 10 और वयस्क 11 दिल के स्लाइस तैयार करने के लिए एक नई विधि स्थापित की। इन व्यवहार्य टिशू स्लाइस का प्रयोग तीव्र प्रयोगों के लिए किया जा सकता है (वयस्क स्लाइसकई घंटे तक खेती की जा सकती है) या अल्पकालिक संस्कृति प्रयोगों (भ्रूण और नवजात के स्लाइस कुछ दिनों के लिए खेती की जा सकती हैं)। स्लाइसें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं की तरह विवो में दिखाती हैं और तीव्र इलेक्ट्रोड एक्शन संभावित और माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग द्वारा मूल्यांकन के रूप में समरूप उत्तेजना फैलता है। उनके "दो आयामी" आकारिकी के कारण, वे वेंट्रिकल के सभी क्षेत्रों में इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की सीधे पहुंच की अनुमति देते हैं, जो उन्हें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच के लिए एक दिलचस्प उपकरण बनाता है और लैंगेंडॉरफ-पेर्फस पूरे दिल के मुकाबले नए प्रयोगात्मक विकल्पों को बढ़ाता है। आयन चैनल ब्लॉकर्स के लिए वारामपिल (एल-टाइप सीए 2 + - चैनल ब्लॉकर), लिडोकाइन (ना + - चैनल ब्लॉकर), 4-एमिनपीरिडाइन (अनएक्लेक्टिव वोल्टेज निर्भर के + + चैनल ब्लॉकर) और लिनोपर्डाइन (केसीएनक्यू के) + -चैनल ब्लॉकर) 9 , 11 10 का सुझाव दिया। इन निष्कर्षों से पता चला है कि म्यूरीन वेंट्रिकुलर स्लाइड्स शारीरिक और औषधीय अध्ययनों के लिए इन विट्रो ऊतक मॉडल के रूप में उपयुक्त हैं। इसके अलावा, तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के साथ मिलकर प्राप्तकर्ता के दिल की निचली स्लाइस ने इलेक्ट्रिकल और मैकेनिकल एकीकरण के साथ-साथ प्रत्यारोपित भ्रूण 12 , 13 , 14 की स्टेम सेल-व्युत्पन्न 15 कार्डियोमोसाइटोइट्स के गुणांकन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण साबित किया है।
संक्षेप में, वेन्ट्रिकुलर स्लाइस एक बहुमूल्य और अच्छी तरह से स्थापित बहुकोशिकीय ऊतक मॉडल हैं और इसे अलग-अलग कार्डिओमायोसाइट्स और लैंगेंडॉरफ-पेर्फेट दिल के पूरक माना जाना चाहिए।कार्डियोवास्कुलर रिसर्च में, ऊतक संरचना (जैसे कि अलग-अलग कोशिकाओं के विपरीत) में विवो में मुहैया कराने के साथ ही हृदय के सभी क्षेत्रों में तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग जैसे संपूर्ण तकनीकों की प्रत्यक्ष पहुंच जैसे पूरे दिल की तैयारी के विपरीत।
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Protocol
पशु संभाल करने के लिए स्थानीय पशु कल्याण समिति के दिशानिर्देशों और यूरोपीय संसद के निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुरूप होना चाहिए।
1. समाधान तैयार करें
- Ca 2+ (एमएम में रचना) के बिना टायरोड के समाधान को तैयार करें: NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 पीओ 4 0.33, एमजीएल 2 1, ग्लूकोज 10, एचईपीईएस 5, 2,3-ब्यूटेनोजियन मॉोनऑक्साइम (बीडीएम) 30. पीएच को 7.4 में समायोजित करें 4 डिग्री सेल्सियस पर NaOH के साथ
- Ca 2+ (एमएम में रचना) के साथ टायरोड के समाधान को तैयार करें: NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO4 0.33, एमजीएल 2 1, ग्लूकोज 10, HEPES 5, बीडीएम 30, CaCl 2 0.9। पीओएच को 7.4 डिग्री सेल्सियस पर NaOH के साथ समायोजित करें
- 4% कम पिघल agarose तैयार: सीए 2 + बिना 15 एमएल Tyrode के समाधान में 0.6 जी कम पिघल agarose रखें। एक माइक्रोवेव ओवन में मिश्रण को 750 बार वाशिंगटन के लिए 750 वें में दो बार गर्म करें। 37 के निरंतर तापमान पर समाधान रखें# 176; सी और लगातार हलचल
- डेलबेको के संशोधित ईगल मध्यम (सीडीआर) के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर कार्बोन्स (5% सीओ 2 , 95% ओ 2 ) के साथ खड़े रहें।
2. माइक्रोट्रॉम तैयार करें
- माइक्रोटॉम पर स्विच करें
- बर्फ के साथ बाहरी सूक्ष्म जीव कक्ष भरें।
- सीए 2 + के बिना बर्फ के ठंडे ट्रायोड के समाधान के साथ आंतरिक माइक्रोट्रॉम चैम्बर भरें और 100% ओ 2 के साथ लगातार ऑक्सीजन बनाना।
- माइक्रोट्रॉम के ब्लेड-होल्डर में एक स्टील ब्लेड रखें।
3. माउस हार्ट अलगाव
- 2,500 यू हेपरिन को घिसलाकर निकालना 15 मिनट प्रतीक्षा करें
- ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पशु को बलिदान करना
- स्टर्नोटमी द्वारा छाती को खोलें
- सावधानी से छोटी कैंची और एक संदंश # 5 का उपयोग कर पेरिकार्डियम काटना।
- आरोही महाधमनी में एक प्रवेशिका डालें और कोरोनरी धमनियों को बर्फ ठंडे ट्रायोड के साथ बसाइये।सीए 2 + के बिना समाधान शेष खून को हटा दिया जाता है।
- धीरे से एक संदंश और कैंची के साथ दिल को फिर से छानना और बर्फ को ठंडा टरोड के समाधान में सीए 2 + के बिना सवार स्थानांतरित करना ।
- एक स्केलपेल या कैंची के साथ निलय से एट्रिआ को अलग करना।
4. 4% में वेंट्रिकल्स के एम्बेडिंग कम-पिघला हुआ एगरोज़
- Agarose ढालना ( चित्रा 1 ) में ऊपर की ओर अग्रक्रिया के साथ निलय के स्थान पर रखें। बाएं निलय कक्ष में ढालना के बीच में पिन रखें।
- 4% कम पिघला हुआ agarose 37 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड भरें, जब तक कि दिल पूरी तरह से कवर नहीं किया जाता है।
- ऊतक के अस्थायी को रोकने के लिए agarose के तेजी से सख्त होने के लिए बर्फ पर मोल्ड रखें।
- एक स्केलपेल के साथ मोल्ड से वेन्ट्रिकल्स युक्त एगारोस ब्लॉक निकालें।
- ब्लॉक उल्टा और वेंट्रिकुलर कक्षों को भरें और agarose ब्लॉक की पीठ पर अंतर, जो मैंमोल्टा के पिन द्वारा छोड़ा, 4% कम पिघला हुआ एगरोज़ एक 20 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर रहा है।
- ब्लॉक के एक सपाट तल को प्राप्त करने और कार्डियक एपेक्स की ईमानदार स्थिति को प्राप्त करने के लिए एक स्केलपेल के साथ agarose ब्लॉक ट्रिम करें।
5. वेंट्रिकुलर टिशू को टुकड़ा करना
- साइनोस्रीलाट गोंद की एक बूंद के साथ माइक्रोोटिम के नमूने धारक पर ब्लॉक को ठीक करें कार्डियक अपैक्स ऊपर का सामना करें
- नमूना धारक को माइक्रोप्रोम के भीतर का नमूना कक्ष में रखें, जो कि सीए 2 + के बिना बर्फ के ठंडे टरोड से भर जाता है। टायरोड के समाधान के साथ पूरी तरह से एग्रोस ब्लॉक को कवर करें।
- अतिरिक्त आवेदन (150-200 माइक्रोन तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए) के आधार पर, 150-400 माइक्रोन की मोटाई पर छोटी अक्ष स्लाइस तैयार करें, 60-70 हर्ट्ज पर ब्लेड का कंपन आवृत्ति रखें और ब्लेड को आगे बढ़ें और धीरे-धीरे आगे बढ़ें ।
- स्लाइस से शेष एगरोज़ को सावधानीपूर्वक निकालने के लिए ठीक ब्रश का उपयोग करें।
- धीरे स्थानांतरणट्योरोड के समाधान में 0.9 एमएम सीए 2+ के साथ 100% हे 2 युक्त वायुसेना में पाश्चर विंदुक के साथ स्लाइस और स्लाइसिंग प्रक्रिया से उबरने के लिए बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए उन्हें स्टोर करें।
- इसके बाद, डीएमईएम में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस रखें, कार्बोन्स के साथ वातित, आगे उपयोग करने से पहले बीडीएम धोने के लिए।
6. तीव्र इलेक्ट्रोड सेटअप की तैयारी
- प्री-हीटिंग के लिए, सभी विद्युत उपकरणों पर रिकॉर्डिंग शुरू होने से 30 मिनट पहले स्विच करें।
- औंधा माइक्रोस्कोप पर रखी ताप प्लेट पर 3 सेमी सेल कल्चर डिश रखें।
- डिश में कस्टम-निर्मित अंगूठी इलेक्ट्रोड ( चित्रा 2 ) रखें और प्री-एम्पलीफायर और उत्तेजना इलेक्ट्रोड के ग्राउंडिंग तारों को कनेक्ट करें।
- डिश में छिड़काव प्रणाली की लचीली ट्यूबों को कनेक्ट करें
- कार्बन के साथ वातित डीएमईएम के साथ छिड़काव प्रणाली के जलाशय को भरें।
- छिड़काव पंप पर स्विच करें और छिड़काव आरए सेट करेंते से 2-3 एमएल / मिनट
- प्रवाह हीटर और हीटिंग प्लेट को नियंत्रित करके 37 डिग्री सेल्सियस के डिश में डीएमईएम का तापमान समायोजित करें।
7. कार्य क्षमता रिकॉर्डिंग
- डीएमईएम भरे पकवान में एक निलय के टुकड़े को रखें।
- उलटे माइक्रोस्कोप के साथ ऊतक की संरचनात्मक अखंडता और व्यवहार्यता (सिकुड़ाए कार्य के आधार पर) की जांच करें।
- 3 एम केसीएल के साथ रिकॉर्डिंग ग्लास इलेक्ट्रोड भरें
- डीएमईएम के साथ उत्तेजना इलेक्ट्रोड भरें
- इलेक्ट्रोड धारकों पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और उत्तेजना इलेक्ट्रोड रखें।
- उत्तेजना इलेक्ट्रोड को टुकड़े पर ध्यान से रखें और इलेक्ट्रिक उत्तेजक उत्तेजक पर स्विच करें। 1-2 हर्ट्ज की उत्तेजना आवृत्ति से प्रारंभ करें
- इरादा रिकॉर्डिंग स्थिति पर micromanipulator के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड ले जाएँ।
- धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को कम करें जब तक टिप ऊतक को छू न जाए।
- इस के माध्यम से एक छोटे आयताकार बिजली के नाड़ी को लागू करेंकोशिका झिल्ली को घुसना करने के लिए इलेक्ट्रोड को रिकॉर्ड करना।
- एक स्थिर संकेत सुनिश्चित होने तक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को ध्यान से व्यवस्थित करें।
- एक्शन क्षमता की रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें
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Representative Results
मायोकार्डिअल इन्फर्क्शन कार्डिओमायोसाइट्स के लगभग अपरिवर्तनीय नुकसान की ओर जाता है। एक्जिजेंशियल कार्डियाक रिजनरेशन के लिए स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमोसाइट्स का उपयोग कर सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी एक होनहार चिकित्सीय दृष्टिकोण है। सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा की सुरक्षा और दक्षता के लिए प्रत्यारोपित कोशिकाओं के विद्युत एकीकरण और परिपक्वता महत्वपूर्ण हैं।
एकीकरण और परिपक्वता का आकलन करने के लिए, हमने प्रेरित चूहों के स्वस्थ दिलों में बढ़ाया हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को अभिव्यक्त करते हुए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएसस्कॉम; 2 इंजेक्शंस 0.5 एक्स 10 6 आईपीएससीएम / 10 μL) से प्राप्त किया है (देखें Peinkofer et al तरीकों का विस्तृत वर्णन के लिए 15 ) प्रत्यारोपण के छह दिन बाद, प्राप्तकर्ता हृदय की निलय के टुकड़े वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए थे। एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग में दिखाया गया हैचित्रा 3 प्रत्यारोपित आईपीएसएससीएम युक्त टुकड़ा डीएमईएम में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था और मेजबान टिश्यू ( चित्रा 3 ए , बाएं) में रखा एक एकध्रुवीय इलेक्ट्रोड द्वारा फोकली प्रेरित किया गया था। ईट्रासेल्युलर एक्शन क्षमताएं ईजीएफपी पॉजिटिव प्रत्यारोपित iPSCM और स्लाइस के अंदर पड़ोस मेजबान टिशू ( चित्रा 3 ए , दाएं) में 3 एम केएलसी से भरे तेज ग्लास माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ दर्ज की गईं।
प्राप्तकर्ता दिलों में प्रत्यारोपित iPSCM की दृढ़ता और विद्युत एकीकरण का प्रदर्शन किया जा सकता है। आईपीएससीएम को विद्युत रूप से एकीकृत माना जाता था, यदि प्रत्यारोपण कर्मियों और एक्शन पॉजिटिवों की स्थैतिक अंतर-निर्भरता प्रत्यारोपित कार्डियोयोमोसाइट्स में दर्ज की गई थी ( चित्रा 3 बी )। बिजली के एकीकरण की गुणवत्ता को विद्युत सक्रियण की देरी से बढ़ाया जा सकता है, अर्थात् उत्तेजनाओं के बीच की देरी और वसूली की शुरुआतई कार्रवाई संभावित अपस्टोक, और अधिकतम उत्तेजना आवृत्ति बिना प्रवाहकत्त्व ब्लॉक, यानी अधिकतम उत्तेजना आवृत्ति जो प्रत्येक उत्तेजना के बाद 1: 1 ऐक्शन पोटेंशिअल की ओर अग्रसर होती है।
इस प्रतिनिधि प्रयोग में प्रत्यारोपित आईपीएसएससीएम विद्युत रूप से एकीकृत किया गया था, जैसा कि अधिक से अधिक उत्तेजना आवृत्ति से लगभग 5 हर्ट्ज ( चित्रा 3 बी , दाएं) के प्रवाहकत्त्व ब्लॉकों के संकेत दिए गए थे, लेकिन युग्मन की गुणवत्ता, मेजबान टिशू के भीतर जितनी अच्छी नहीं थी, उतनी अधिक समय तक इंगित की गई थी उत्तेजना कलात्मक और कार्रवाई संभावित अपस्टोक (मेजबान टिशू: 8 एमएस; आईपीएससीसीएम: 20 एमएस) में देरी मेजबान कार्डियोयोमोसाइट्स की कार्य क्षमता में 84 एमवी आयाम, -74 एमवी अधिकतम दांतों की क्षमता, 11 एमएस की अवधि 50% रिप्ररराइजेशन, 108 एमएस की अवधि 90% रिप्ररराइजेशन और 114 से अधिक वी / एस के एक वेगवान वेग उत्तेजना आवृत्ति को 1 से 5 हर्ट्ज़ तक बढ़ाना, संभावित संभावित डयूराट में कमी के कारण होता हैआयन का 90% रिप्ररराइजेशन (86 एमएस) प्रत्यारोपित आईपीएसएससीएम ने कार्रवाई संभावित गुणों में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। मेजबान कोशिकाओं की तुलना में, आयाम छोटा था (53 एमवी), अधिकतम डायस्टोलिक संभावित कम नकारात्मक (-54 एमवी), 50% रिप्रोर्यूएशन की अवधि बढ़ी (14 एमएस), 90% रिप्रोरियेशन की अवधि (9 0 एमएस) और स्टास्टोक वेग धीमा (57 वी / एस) उत्तेजना आवृत्ति में 1 से 5 हर्ट्ज़ में वृद्धि ने संभावित 90% रिपोलराइजेशन (67 एमएस) में संभावित ऐक्शन में कमी का कारण बना। अंत में, प्रत्यारोपण के 6 दिनों के बाद इस प्रतिनिधि के उदाहरण में, आईएसकेसीएम का विश्लेषण किया गया था कि अपरिपक्व कार्डिओमोसाइटोइट्स की विशिष्ट विशेषताएं। यह मौलिक निष्कर्ष सांख्यिकीय रूप से पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं और तैयारियों के माप के अनुरूप है, जो 15 से पहले की सूचना मिली है।
आकृति 1: Agarose में वेंट्रिकल्स को एम्बेड करने के लिए कस्टम-मेड मोल्ड इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: तीव्र इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए कस्टम-रिंग इलेक्ट्रोड (ग्राउंड)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: प्रत्यारोपित आईपीएसएससीएम का विद्युत एकीकरण । ( ए ) वांछित दिल का टुकड़ा (बाएं) जिसमें ईजीएफपी पॉजिटिव आईपीएसएससीएम (दाएं) शामिल हैं। एसई:उत्तेजना इलेक्ट्रोड लाल डॉट्स रिकॉर्डिंग के स्थान को चिन्हित करते हैं। ( बी ) स्वस्थ मेजबान टिशू (ऊपरी निशान) और प्रत्यारोपित आईपीएसएससीएम (निचला निशान) में कार्य क्षमता रिकॉर्डिंग। स्लाइस को फोकली उत्तेजना इलेक्ट्रोड के साथ उत्तेजित किया गया था जो मेजबान टिशू में 2 हर्ट्ज (बायां निशान) और 5 हर्ट्ज (सही निशान) पर रखा गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
वेंट्रिकुलर स्लाइस, हृदय के सभी क्षेत्रों में ऊतक संरचना और माप प्रौद्योगिकी की प्रत्यक्ष पहुंच जैसे विवो में संरक्षित साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, फार्माकोलॉजिकल और मैकेनिकल अध्ययन को सक्षम करते हैं। भौतिक ऐक्शन संभावित गुण भ्रूण, नवजात और वयस्क स्लाइस 9 , 10 , 11 में प्रदर्शित किए गए हैं। स्लिसिंग प्रक्रिया द्वारा सीधे सतह क्षतिग्रस्त सतह परतों को छोड़कर, स्लाइसों की ज़िन्दगी, जीवनशक्ति धुंधला 9 द्वारा पुष्टि की गई है। तेज ग्लास इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हुए स्लाइस के भीतर संभावित रिकॉर्डिंग का इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा वर्णित है या प्रत्यारोपित कार्डियोयोमोसाइट्स के एकीकरण और परिपक्वता की जांच करने के लिए, या कार्डियैक्टीक यौगिकों को जोड़ने के बाद औषधीय अध्ययन के लिए किया जा सकता है। व्यक्तिगत सेल में एक घंटे या अधिक की अवधि के साथ दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग संभव हैं। यह रिकॉर्डिंग अवधि परीक्षण के लिए पर्याप्त हैअनुक्रमिक छिड़काव और धोने से एक सेल पर विभिन्न औषधीय यौगिकों का प्रभाव।
महत्वपूर्ण तैयारी कदम
टुकड़ा गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए, इस्कीमिक ऊतक क्षति से बचा जाना चाहिए। इसलिए, टायरोड के समाधान के साथ हृदय में छिड़काव, तेजी से हृदय शल्य चिकित्सा और बर्फ के ऑक्सीजन युक्त ट्रायोड के समाधान में तत्काल संरक्षण को महत्वपूर्ण माना जाता है। 2,3-ब्यूटेनएडीओन मोनोक्साइम का उपयोग करते हुए पिटाई दिल का स्थिरीकरण आइसकेमिया के लिए संवेदनशीलता को और कम कर सकता है और कम पिघला हुआ एगरोज़ में एक ठोस एम्बेडिंग के लिए आवश्यक है। कम-पिघला हुआ agarose में डालने से प्रसार को सीमित करके ऊतक की आपूर्ति में बाधा आ सकती है, लेकिन टुकड़े टुकड़े करने से पहले नरम दिल के ऊतकों को स्थिर करने के लिए आवश्यक है। नमूना ब्लॉक के भीतर छोटे गुहाएं, जैसे वायुमंडल कक्षों को पूरी तरह से agarose या हवा के बुलबुले से भरा नहीं, ऊतक स्थिरीकरण में बाधा उत्पन्न हो सकती है। अस्थिरित म्योकार्डियल ऊतक पर्याप्त रेजिस की पेशकश नहीं करता हैहिल ब्लेड, जो गंभीर ऊतक व्यवधान और क्षति का कारण बनता है स्पष्ट कटौती सुनिश्चित करने के लिए और ऊतक के नुकसान को कम करने के लिए, ब्लेड तेज होनी चाहिए ( यानी तीन बार से अधिक बार पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए), और नमूना ब्लॉक के माध्यम से ब्लेड के आगे आंदोलन जितना धीमा हो उतना धीमा होना चाहिए, क्योंकि नीरस ब्लेड या ओवरस्पीडिंग एम्बेडेड निलय या ऊतक को चकनाचूर।
विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए, स्लाइस की गुणवत्ता को विशिष्ट मानदंडों को पूरा करना चाहिए, जिनमें ऊतक की संरचनात्मक अखंडता शामिल है, जिसे माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जा सकती है, और शारीरिक हड़पने की प्रतिक्रिया में 10 हर्ट्ज तक की शारीरिक आवृत्ति
आगे के आवेदन के आधार पर 150-400 सुक्ष्ममापी की मोटाई पर स्लाइस काटा जा सकता है। जबकि पतले स्लाइस ऊतक कोर में हाइपोक्सिक स्थितियों को रोका जा सकता है और प्रत्यारोपित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ-साथ अधिक सटीक पोजिशनिंग के आसान पहचान की अनुमति देता हैइलेक्ट्रोड 15 रिकॉर्डिंग, मोटा स्लाइस ऊतक संरचना और ऊतक की उच्च स्थिरता की बेहतर अखंडता प्रदान कर सकते हैं, जो बल के माप के लिए लाभप्रद होगा 10 और रिकॉर्डिंग के बाद और हॉिसटोलॉजिकल प्रोसेसिंग।
आयन चैनलों पर उच्च बीडीएम सांद्रता और सीए 2 + हैंडलिंग प्रोटीन 16 , 17 , बीडीएम धोने के संभावित प्रभावों को रोकने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए बीडीएम मुक्त डीएमईएम में स्लाइस के ऊष्मायन से पहले उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हैरानी की बात है, बीडीएम धोने के बाद ऊतक के संकुचन और बाद के आंदोलन तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग में बाधा नहीं आते हैं।
सीमाएं
आम सेल संस्कृति मॉडल के विपरीत, स्लाइस एक अक्षुण्ण ऊतक संरचना प्रदान करता है जिसमें संरक्षित विद्युत और मैकेनिकल कोशिकाएं सेल कनेक्शन, बाह्य मैट्रिक्स और कार्डिओमायोसी का वितरण शामिल हैंदेशी ऊतक 6 में टीईएस और गैर-मायोकाइट्स हालांकि, हृदयात्मक टिशू स्लाइस विवो स्थिति से बिल्कुल मेल नहीं खाते, क्योंकि वे सिर्फ 150-400 माइक्रोन मोटी हैं, कृत्रिम माध्यम द्वारा आपूर्ति की जाती हैं और तैयारी प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकती है। ट्राइपैन नीले धुंधला हो जाना और सक्रिय कस्पासे -3 और पीआरपी पी 85 के टुकड़े के इम्युनोहिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन से पता चला है कि भ्रूण के स्लाइस के अंदर की सतह, सतह परतों के उन लोगों को छोड़कर, 9 टुकड़ा करने के बाद व्यावहारिक थे
वेंट्रिकुलर स्लाइस में प्रवाहकत्त्व प्रणाली संरक्षित नहीं है, और उत्तेजना फैलता फ्लैट स्लाइस में तीन आयामी के बजाय दो आयामी है। भ्रूण के दिलों से स्लाइस संस्कृति 9 में दो सप्ताह तक सहज रूप से मार रहे हैं वयस्क स्लाइस के स्वस्थ संकुचन भी हो सकते हैं, और यह अस्पष्ट है कि क्या वे प्रवाहकत्त्व प्रणाली की कोशिकाओं द्वारा प्रेरित हैं या सेल क्षति और सीए 2 + ओवरल से संकेत मिलता हैओड 18
भविष्य के अनुप्रयोग
तेज इलेक्ट्रोड और माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के अलावा, जो औषधीय प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि संभावित प्रभावों और उत्तेजनाओं पर दवाओं के प्रभाव का विश्लेषण किया जा सके, 11 , विकास संबंधी अध्ययन 1 9 या प्रत्यारोपित कार्डिओयोमायसाइट्स के लक्षण वर्णन 15 जैसा ऊपर दिखाया गया है, नवजात के निलय के स्लाइस दिल का उपयोग बल संकुचन माप 10 के लिए किया गया है, जो वयस्क स्लाइस पर भी लागू किया जा सकता है आगे संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों में शामिल हैं (I) खेती की हुई स्लाइस में दीर्घकालिक माइक्रोस्कोपी के अध्ययन, उदाहरण के लिए इंजेक्शन स्टेम कोशिका-व्युत्पन्न कार्डियोमोसाइट्स के संरचनात्मक एकीकरण का आकलन, (द्वितीय) अंतर जंक्शन के लिए पारगम्य रंजक इंजेक्शन की जांच करने के लिए इंटरसेल्युलर युग्मन या (III) एंडोथेलियल का अध्ययन और कोरोना के संवहनी समारोहस्लाइस के भीतर रसीला बर्तन
निष्कर्ष में, वेन्ट्रिकुलर स्लाइस एक मूल्यवान बहुकोशिकीय ऊतक मॉडल हैं, जो संरचना की तरह विवो में संरक्षित होते हैं, जो आम सेल संस्कृति मॉडल की सीमाओं पर काबू पाने में मदद कर सकते हैं और एक व्यापक श्रेणी के औषधीय, शारीरिक, विकास और सेल थेरेपी अध्ययनों के लिए लागू होते हैं।
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Disclosures
लेखकों को घोषित करने के लिए कुछ नहीं है
Acknowledgments
हम कार्यशालाओं और न्यूरोफिज़ियोलॉजी संस्थान की पशु सुविधा द्वारा प्रदान किए गए समर्थन को स्वीकार करते हैं। यह काम वाल्टर अंड मार्ग बोले-स्टिचुंग, कोल्न फॉर्च्यून और ड्यूश स्टिफ़ंग फर हेर्ज़फ़ोर्सचुंग द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
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