Summary
Hier beschrijven we de voorbereiding van levensvatbare ventriculaire plakjes van volwassen muizen en hun gebruik voor scherpe elektrodeactiepotentiële opnamen. Deze multicellulaire preparaten leveren een geconserveerde in vivo weefselstructuur, waardoor ze in vitro een waardevol model vormen voor elektrofysiologische en farmacologische studies.
Abstract
Murine cardiomyocyten zijn uitgebreid gebruikt voor in vitro studies van hartfysiologie en nieuwe therapeutische strategieën. Echter, multicellulaire preparaten van gedissocieerde cardiomyocyten zijn niet representatief voor de complexe in vivo structuur van cardiomyocyten, niet-myocyten en extracellulaire matrix, die zowel mechanische als elektrofysiologische eigenschappen van het hart beïnvloedt. Hier beschrijven we een techniek om levensvatbare ventriculaire plakjes volwassen muisharten te bereiden met een behoud van in vivo weefselstructuur en hun geschiktheid voor elektrofysiologische opnamen aan te tonen. Na afscheiding van het hart worden ventrikels gescheiden van de atria, geperfumeerd met Ca2 + -vrije oplossing die 2,3-butaandionmonoxime bevat en ingebed in een 4% laagsmelt agarose blok. Het blok is op een microtome geplaatst met een trillend mes en weefselschijfjes met een dikte van 150-400 μm zijn bereid om de vibratie vrij te houdenFrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren. De dikte van de plakjes hangt af van de verdere toepassing. Plakjes worden opgeslagen in ijskoude Tyrode's oplossing met 0,9 mM Ca 2+ en 2,3-butandiolmonoxime (BDM) gedurende 30 minuten. Daarna worden plakken over 30 minuten overgebracht naar 37 ° C DMEM om de BDM uit te spoelen. Plakjes kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische studies met scherpe elektroden of micro-elektrode arrays, voor krachtsmetingen om contractiele functie te analyseren of om de interactie van getransplanteerde stamcel-afgeleide cardiomyocyten en gastheerweefsel te onderzoeken. Voor scherpe elektrode opnames wordt een plak in een 3 cm celcultuurschotel geplaatst op de verwarmingsplaat van een omgekeerde microscoop. De plak wordt gestimuleerd met een unipolaire elektrode, en intracellulaire actiepotenties van cardiomyocyten in de plak worden opgenomen met een scherpe glaselektrode.
Introduction
Weefselschijfjes zijn vaak gebruikt in de basiswetenschap, aangezien Yamamot en Mcllwain in 1966 toonden dat de elektrische activiteit van hersenschijfjes in vitro 1 wordt behouden. Sindsdien zijn elektrofysiologische en farmacologische studies uitgevoerd op plakjes van hersenen 2 , lever 3 , long 4 en myocardiaal weefsel 5 , 6 , 7 . Eerste patch-clamp opnames in ventriculaire plakjes van neonatale rat harten werden beschreven in 1990 8 , maar deze techniek viel al een tijdje in vergetelheid. Meer dan een decennium later vestigde onze groep een nieuwe methode om muizen embryonale 9 , neonatale 10 en volwassen 11 hartschijven te bereiden. Deze levensvatbare weefselplakken kunnen worden gebruikt voor acute experimenten (volwassen plakS kunnen meerdere uren worden gekweekt) of korte-termijncultuur experimenten (embryonale en neonatale plakjes kunnen enkele dagen worden gekweekt). Plakjes tonen in vivo zoals elektrofysiologische kenmerken en een homogene excitatieverspreiding zoals beoordeeld door scherp elektrode-actiepotentieel en micro-elektrode-opnamen 11 . Door hun "tweedimensionale" morfologie bieden ze rechtstreekse toegang tot opnameelektroden aan alle gebieden van de ventrikel, waardoor ze een interessant instrument zijn voor elektrofysiologische onderzoeken en nieuwe experimentele opties opbouwen in vergelijking met Langendorff-perfuse gehele harten. Drugrespons van de plakjes naar ionenkanaalblokkers zoals verapamil (L-type Ca 2+ -kanaalblokker), lidocaïne (Na + -kanaalblokker), 4-aminopyridine (niet-selectieve spanningsafhankelijke K + -kanaalblokker) en linopirdine (KCNQ K + -kanaalblokkeraar) 9 , 11 10 voor . Deze bevindingen aangetoond dat murine ventriculaire plakjes geschikt zijn als een in vitro weefselmodel voor fysiologische en farmacologische studies. Bovendien zijn ventriculaire snijpunten van ontvanger harten in combinatie met scherpe elektrode opnames een zeer behulpzaam hulpmiddel om elektrische en mechanische integratie te identificeren, evenals rijping van transplantaat van 12 , 13 , 14 en stamcellen afgeleide 15 cardiomyocyten.
Samenvattend zijn ventriculaire plakjes een waardevol en goed vast te stellen multicellulair weefselmodel en moeten beschouwd worden als complementair aan gedissocieerde cardiomyocyten en Langendorff-geperfuseerde hartenIn het hart- en vaatonderzoek, met het grootste voordeel van het leveren van een in vivo- weefselstructuur (in tegenstelling tot dissociatiecellen), evenals de directe toegang van meettechnologieën zoals scherpe elektrodeopnamen naar alle hartstreken (in tegenstelling tot hartpreparaten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierbehandeling moet voldoen aan de richtlijnen van het lokale dierenwelzijnscomité en aan de Richtlijn 2010/63 / EU van het Europees Parlement.
1. Bereid Oplossingen voor
- Bereid de oplossing van Tyrode zonder Ca 2+ (samenstelling in mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butandiolmonoxime (BDM) Met NaOH bij 4 ° C.
- Bereid Tyrode's oplossing met Ca2 + (samenstelling in mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH2P04 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Pas de pH aan op 7,4 met NaOH bij 4 ° C.
- Bereid 4% low-melt agarose: Zet 0,6 g laagsmelt agarose in 15 ml Tyrode's oplossing zonder Ca 2+ . Verhit het mengsel tweemaal bij 750 W gedurende 10-15 s tot de agarose opgelost is. Houd de oplossing bij een constante temperatuur van 37 &# 176; C en roer continu.
- Bewaar Dulbecco's Gemodificeerde Eagle Medium (DMEM) zonder serum bij 37 ° C met carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ) geborreld.
2. Bereid de Microtome voor
- Schakel de microtome in.
- Vul de buitenste microtoomkamer met ijs.
- Vul de innerlijke microtoomkamer met ijskoude Tyrode's oplossing zonder Ca 2+ en zet de oplossing voortdurend met 100% O 2 .
- Plaats een stalen mes in de meshouder van de microtome.
3. Muis Hart Isolatie
- Injecteer 2.500 U heparine subcutaan. Wacht 15 minuten.
- Offer het dier door cervicale dislocatie.
- Open de borst door sternotomie.
- Ontleed het pericardium zorgvuldig met behulp van een kleine schaar en een tang # 5.
- Plaats een canule in de oplopende aorta en vul de kransslagaders in situ met ijskoude Tyrode'sOplossing zonder Ca 2+ tot het resterende bloed wordt verwijderd.
- Zet het hart voorzichtig met een tang en een schaar en verplaats het hart in ijskoude Tyrode's oplossing is gereden zonder Ca 2+ .
- Scheep de atria uit de ventrikels met een scalpel of een schaar.
4. Inbedding van de ventrikels in 4% Low-Melt Agarose
- Plaats de ventrikels met de top naar boven in de agarosevorm ( Figuur 1 ). Plaats de pen in het midden van de mal in de linker ventrikelkamer.
- Vul de mal met 4% lage smelt agarose bij 37 ° C tot het hart volledig is bedekt.
- Leg de mal op ijs voor een snellere verharding van de agarose die het drijven van het weefsel voorkomt.
- Verwijder het agarose blok dat de ventrikels uit de mal met een scalpel bevat.
- Draai het blok ondersteboven en vul ventriculaire kamers en de spleet op de achterkant van het agarose blok, welke ikS gelaten door de speld van de molt, met 4% laagmelt agarose met behulp van een injectiespuit met een 20 G-naald.
- Trim het agarose blok met een scalpel om een platte bodem van het blok te bereiken en de rechtopstand van de harttap.
5. Snijden van de ventriculaire weefsel
- Bevestig het blok op de specimenhouder van de microtome met een druppel cyanoacrylaatlijm. Ga naar de harttoppen omhoog.
- Plaats de monsterhouder in de binnenste kamer van de microtome, die gevuld is met ijskoude Tyrode zonder Ca 2+ . Dek het agarose blok volledig met Tyrode's oplossing.
- Bereid kortgesneden plakken met een dikte van 150-400 μm, afhankelijk van de verdere toepassing (voor scherpe elektrode opnames 150-200 μm), houd de trillingsfrequentie van het mes bij 60-70 Hz en beweeg het mes zo langzaam mogelijk naar voren .
- Gebruik een fijne poets om de resterende agarose zorgvuldig uit de plakken te verwijderen.
- Voorzichtig transfeR plakjes met een Pasteur pipette in de Tyrode oplossing met 0,9 mM Ca 2+ belucht met 100% O 2 en houd ze gedurende tenminste 30 minuten op ijs om ze te herstellen uit de snijprocedure.
- Daarna houd u 30 minuten schijfjes in DMEM bij 37 ° C, beluchten met carbogen, om BDM uit te spoelen voor verder gebruik.
6. De Sharp Electrode Setup voorbereiden
- Voor voorverwarming, schakel alle elektrische apparaten 30 minuten in voordat de opnames starten.
- Zet een 3 cm celcultuurschotel op de verwarmingsplaat geplaatst op de omgekeerde microscoop.
- Plaats de op maat gemaakte ringelektrode (afbeelding 2 ) in de schotel en verbind de aardkabels van de voorversterker en de stimulatie-elektrode.
- Sluit de flexibele buizen van het perfusiesysteem aan op de schotel.
- Vul het reservoir van het perfusiesysteem met DMEM, belicht met carbogen.
- Schakel de perfusiepomp in en zet de perfusie-raTe 2-3 ml / min.
- Stel de temperatuur van DMEM in het gerecht op tot 37 ° C door de stookverwarming en de verwarmingsplaat te regelen.
7. Actieve potentiële opnames
- Plaats een ventrikelschijf in de DMEM-vulling.
- Controleer de structurele integriteit en levensvatbaarheid (gebaseerd op contractiele functie) van het weefsel met de omgekeerde microscoop.
- Vul een opnameglaselektrode met 3 M KCL.
- Vul een stimulatie-elektrode met DMEM.
- Plaats de opnamelektrode en de stimulatieelektrode op de elektrodenhouders.
- Plaats de stimulatie-elektrode zorgvuldig op de plak en zet de elektrische stimulator aan. Begin met een stimuleringsfrequentie van 1-2 Hz.
- Verplaats de opnamelektrode met de micromanipulator over de beoogde opname positie.
- Laat de opnameelektrode langzaam zakken tot de punt het weefsel raakt.
- Breng een korte rechthoekige elektrische puls door deOpname elektrode om het celmembraan te penetreren.
- Zet de opnameelektrode voorzichtig terug totdat een stabiel signaal is gewaarborgd.
- Begin met opname van actiepotenties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myocardinfarct leidt tot een vrijwel onomkeerbaar verlies van cardiomyocyten. Celvervangende therapie met behulp van stamcellen afgeleide cardiomyocyten voor exogene hartregeneratie is een veelbelovende therapeutische aanpak. Elektrische integratie en rijping van de getransplanteerde cellen zijn cruciaal voor de veiligheid en efficiëntie van celvervangende therapie.
Om integratie en rijping te beoordelen, hebben we getransplanteerde cardiomyocyten afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCM; 2 injecties van 0,5 x 106 iPSCM / 10 μL) die verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) tot expressie brengen in gezonde harten van volwassen muizen (zie Peinkofer et al. Voor een gedetailleerde beschrijving van methoden 15 ). Zes dagen na transplantatie werden ventriculaire plakjes ontvanger harten bereid volgens het beschreven protocol. Een representatieve opname wordt getoond inFiguur 3. Een plakje die getransplanteerd iPSCM bevatte werd in 37 ° C in DMEM geplaatst en focaal gestimuleerd door een unipolaire elektrode geplaatst in gastheerweefsel ( Figuur 3A , links). Intracellulaire actiepotentialen werden geregistreerd met scherpe glasmicro-elektroden gevuld met 3 M KCl in eGFP positief getransplanteerd iPSCM en naburig gastheerweefsel in de plakjes ( Figuur 3A , rechts).
Persistentie en elektrische integratie van getransplanteerde iPSCM in ontvanger harten kan aangetoond worden. IPSCM werd geacht elektrisch geïntegreerd te zijn, als een temporele interafhankelijkheid van stimulatie-artefacten en actiepotenties die intracellulair werden opgenomen in getransplanteerde cardiomyocyten aanwezig waren ( Figuur 3B ). De kwaliteit van de elektrische integratie kan gekwantificeerd worden door de vertraging van de elektrische activering, dwz de vertraging tussen de stimulus en het begin van de thE actiepotentieel oplopen en de maximale stimulatie frequentie zonder geleidingsblokken, dwz de maximale stimulatie frequentie die leidt tot een 1: 1 generatie actiepotentiaal na elke stimulus.
Gediplomeerde iPSCM in dit representatieve experiment werden elektrisch geïntegreerd, zoals aangegeven door een maximale stimulatiefrequentie zonder geleidingsblokken van ongeveer 5 Hz ( Figuur 3B , rechts), maar de kwaliteit van de koppeling was niet zo goed als in het gastheerweefsel zoals aangegeven door de langer Vertraging tussen stimulatie artefact en actiepotentieel upstroke (gastheerweefsel: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Actiepotenties van gastheerkardiomyocyten hadden 84 mV amplitude, -74 mV maximale diastolische potentieel, 11 ms duur bij 50% repolarisatie, 108 ms duur bij 90% repolarisatie en een opslagsnelheid van 114 V / s. Het verhogen van de stimulatie frequentie van 1 tot 5 Hz leidt tot een daling van de actiepotentieel duratIon bij 90% repolarisatie (86 ms). Gediplomeerde iPSCM vertoonde significante verschillen in de eigenschappen van de actiepotentiaal. In vergelijking met gastheercellen was de amplitude kleiner (53 mV), het maximale diastolische potentieel minder negatief (-54 mV), de duur bij 50% repolarisatie verhoogd (14 ms), de duur bij 90% repolarisatie korter (90 ms) en de opslagsnelheid Langzamer (57 V / s). Een toename van de stimulatiefrequentie van 1 tot 5 Hz veroorzaakte een daling van de actiepotentiaalduur bij 90% repolarisatie (67 ms). Concluderend, in dit representatieve voorbeeld op 6 dagen na transplantatie vertoonde de geanalyseerde iPSCM typische kenmerken van onvolwassen cardiomyocyten. Deze anekdotische bevinding is in lijn met metingen in een statistisch voldoende aantal cellen en preparaten, die eerder zijn gerapporteerd voor 15 .
Figuur 1: Maatwerk voor het inbouwen van ventrikels in agarose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Op maat gemaakte ringelektrode (grond) voor scherpe elektrode opnames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Elektrische integratie van getransplanteerde iPSCM . ( A ) Ventriculaire hartschijf (links) met eGFP-positieve iPSCM (rechts). SE:Stimulatie elektrode. Rode punten markeren de locatie van de opnames. ( B ) Actieve potentiële opnames in gezond gastheerweefsel (bovenste sporen) en getransplanteerde iPSCM (lagere sporen). De plak werd focaal gestimuleerd met een stimulatie-elektrode die in gastheerweefsel geplaatst werd op ongeveer 2 Hz (linker sporen) en 5 Hz (rechter sporen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ventriculaire plakjes maken elektrofysiologische, farmacologische en mechanische studies mogelijk met een behouden in vivo weefselstructuur en directe toegang van de meettechnologie naar alle regio's van het hart. Fysiologische actiepotentieel eigenschappen zijn aangetoond in embryonale, neonatale en volwassen plakjes 9 , 10 , 11 . De vitaliteit van de plakjes, behalve de oppervlaktelagen die direct beschadigd zijn door de snijprocedure, is bevestigd door vitaliteitsverf 9 . Actieve potentiële opnamen in de plakjes met behulp van scherpe glaselektroden kunnen gebruikt worden om integratie en rijping van getransplanteerde cardiomyocyten zoals hier beschreven te onderzoeken of voor farmacologische studies na toevoeging van cardioactieve verbindingen. Langdurige opnames met een duur van één uur of meer in een individuele cel zijn mogelijk. Deze opname duur is voldoende om te testenDe invloed van verschillende farmacologische verbindingen op één cel door opeenvolgende perfusie en uitwassen.
Kritische voorbereidingsstappen
Om de plakkwaliteit te optimaliseren, moet ischemische weefselschade vermeden worden. Daarom wordt perfusie van het hart in situ met de oplossing van Tyrode, snelle hartresectie en direct behoud in ijskoude zuurstofoplossing van Tyrode als cruciaal beschouwd. Immobilisatie van het kloppend hart door gebruik te maken van 2,3-butanedionmonoxime kan de gevoeligheid voor ischemie verder verminderen en is vereist voor een solide inbedding in laagsmeltaire agarose. Embedding in laagsmelt-agarose kan de weefselvoorziening beperken door diffusie te beperken, maar is essentieel om het zachte hartweefsel te stabiliseren alvorens te snijden. Kleine holtes in het monsterblok, bijv. Ventriculaire kamers die niet volledig gevuld zijn met agarose of overblijvende luchtbellen, kunnen de stabilisatie van het weefsel belemmeren. Ongestabiliseerd myocardiaal weefsel biedt niet voldoende resisTanks op het vibrerende mes, wat ernstige verstoring en beschadiging van het weefsel veroorzaakt. Om een scherpe snede te garanderen en de weefselbeschadiging te minimaliseren, moeten de schoepen scherp zijn ( dwz niet meer dan drie keer hergebruikt) en de voorwaartse beweging van het mes door het monsterblok moet zo langzaam mogelijk zijn, aangezien saaie bladen of overspanning de Ingebedde ventrikels of het weefsel afbreken.
Om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te waarborgen, moeten de kwaliteit van plakjes voldoen aan specifieke criteria, inclusief de structurele integriteit van het weefsel, dat kan bevestigd worden door microscopie en respons op elektrische stimulatie bij fysiologische kloppingsfrequenties tot 10 Hz.
Plakjes kunnen worden gesneden met een dikte van 150-400 μm, afhankelijk van de verdere toepassing. Terwijl dunner plakjes hypoxische omstandigheden in de weefselkern kunnen voorkomen en gemakkelijker detecteren van getransplanteerde cellen met een fluorescentiemicroscoop en nauwkeuriger positionering vanOpnameselektroden 15 kunnen dikker plakken een betere integriteit van de weefselstructuur en hogere stabiliteit van het weefsel verschaffen, die voor de krachtmetingen 10 en verdere histologische verwerking na opnames voordelig zal zijn.
Om te voorkomen dat mogelijke invloeden van hoge BDM concentraties op ionenkanalen en Ca 2+ behandelingsproteïnen 16 , 17 , BDM uitwassen door incubatie van plakjes in BDM vrije DMEM gedurende tenminste 30 minuten voor verdere gebruik, worden aanbevolen. Verrassend is dat de samentrekking en de daaropvolgende beweging van het weefsel na het uitwassen van BDM geen scherpe elektrodeopnamen belemmeren.
beperkingen
In tegenstelling tot de gemeenschappelijke celcultuurmodellen zorgen schijven voor een intacte weefselstructuur met inbegrip van bewaarde elektrische en mechanische cel naar celverbindingen, extracellulaire matrix en verspreiding van cardiomyocyTes en niet-myocyten in het natieve weefsel 6 . Echter, cardiovasculaire plakjes passen niet precies overeen met de in vivo situatie, omdat ze slechts 150-400 μm dik zijn, geleverd door kunstmatig medium en kunnen tijdens het voorbereidingsproces beschadigd raken. Trypanblauwvlek- en immunohistologische evaluatie van actief caspase-3 en PARP p85 fragment bleek dat cellen binnen embryonale plakjes, behalve die in de oppervlaktelagen, levensvatbaar waren na snijden 9 .
Het geleidingssysteem wordt niet bewaard in ventriculaire plakjes, en excitatiespreiding is tweedimensionaal in plaats van driedimensionaal in de platte segmenten. Plakjes van embryonale harten tonen spontane klagen gedurende maximaal twee weken in cultuur 9 . Spontane samentrekkingen van volwassen plakjes kunnen ook optreden, en het is onduidelijk of zij door cellen van het geleidingssysteem worden geïnduceerd of kunnen leiden tot celschade en Ca 2+ overlOad 18 .
Toekomstige toepassingen
Naast elektrofysiologische studies met scherpe elektroden en microelektrode arrays, die kunnen worden gebruikt voor farmacologische experimenten om de invloed van drugs op actiepotentiaal eigenschappen en excitatieverdeling 11 te analyseren, ontwikkelingsstudies 19 of karakterisering van getransplanteerde cardiomyocyten 15 zoals hierboven getoond, ventriculaire plakjes neonatale Harten zijn gebruikt voor krachtcontractiemetingen 10 , die ook op volwassen plakjes kunnen worden toegepast. Verdere mogelijke toekomstige toepassingen omvatten (I) lange-termijn microscopie studies in gekweekte segmenten, bijv. Om de structurele integratie van geïnjecteerde stamcellen afgeleide cardiomyocyten te beoordelen, (II) injectie van doorlatende doorlaatpermeabele kleurstoffen naar onderzocht intercellulaire koppeling of (III) studies van endotheliale En vaatfunctie van coronaRy schepen binnen de plakjes.
Concluderend zijn ventriculaire plakjes een waardevol multicellulair weefselmodel met behoud van in vivo- achtige structuur, die kan helpen om beperkingen van gemeenschappelijke celcultuurmodellen te overwinnen en zijn van toepassing op een breed scala van farmacologische, fysiologische, ontwikkelings- en celtherapie studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Wij erkennen de ondersteuning die wordt verstrekt door de workshops en de dierfaciliteit van het Institute of Neurophysiology. Dit werk werd ondersteund door Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune en Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
