मल्टी-इलेक्ट्रोड एरे पर सुसंस्कृत माउस न्यूरॉनल कोशिकाओं विद्युत उत्तेजना के बाद प्रतिक्रिया में वृद्धि दर्शाती हैं। यह प्रोटोकॉल कैसे संस्कृति न्यूरॉन्स, कैसे गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, और उत्तेजना के पैटर्न का जवाब करने के लिए नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए कैसे दर्शाता है।
माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) का इस्तेमाल दवा की विषाक्तता, अगली पीढ़ी के व्यक्तिगत मेडिसिन के लिए डिजाइन मानदंडों और न्यूरोनल संस्कृतियों में नेटवर्क गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। पैच-क्लैंपिंग जैसे पारंपरिक तरीकों के विपरीत, जो केवल एक सेल से गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकता है, विदेश मंत्रालय प्रत्येक नेटवर्क पर एक से कई साइटों से एक साथ रिकॉर्ड कर सकते हैं, बिना प्रत्येक इलेक्ट्रोड को अलग-अलग रखने का कठिन काम किए बिना। इसके अलावा, कई नियंत्रण और उत्तेजना विन्यास को आसानी से एक ही प्रयोगात्मक सेटअप में लागू किया जा सकता है, जिससे पता लगाया जा सकता है कि गतिशीलता की एक व्यापक श्रेणी की अनुमति है। इन इन विट्रो अध्ययनों में दिलचस्पी की मुख्य गतिशीलता में से एक यह है कि किस सुसंस्कृत नेटवर्क में गुण प्रदर्शित होता है जो सीखने का संकेत मिलता है। विदेश मंत्रालय द्वारा सुसंस्कृत माउस न्यूरॉनल सेल, विद्युत उत्तेजना से प्रेरित प्रशिक्षण के बाद प्रतिक्रिया में वृद्धि दर्शाते हैं। यह प्रोटोकॉल इस बात को दर्शाता है कि विदेश मंत्रालय की संस्कृति न्यूरॉनल कोशिकाएं कैसे हैं; सफलतापूर्वक पुनःमढ़वाया व्यंजन का 95% से अधिक कॉर्ड; उत्तेजना के पैटर्न का जवाब देने के लिए नेटवर्क को प्रशिक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करें; और इस तरह के प्रयोगों के परिणामों को सॉर्ट, प्लॉट, और व्याख्या करते हैं। उत्तेजक और न्यूरोनल संस्कृतियों के रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वामित्व प्रणाली का उपयोग किया जाता है। सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग न्यूरोनल इकाइयों को क्रमबद्ध करने के लिए भी किया जाता है एक कस्टम-डिज़ाइन ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस का प्रयोग पोस्ट-प्रेसिजन टाइम हिस्टोग्राम, इंटर फॉस्ट अंतराल, और फट अवधि के साथ-साथ प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के पहले और बाद में उत्तेजना के सेलुलर प्रतिक्रिया की तुलना करने के लिए किया जाता है। अंत में, इस अनुसंधान प्रयास के प्रतिनिधि परिणाम और भविष्य के दिशा-निर्देशों पर चर्चा की जाती है।
माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) का उपयोग दवा की विषाक्तता, अगली पीढ़ी के व्यक्तिगत मेडिसिन के लिए डिजाइन मानदंडों और न्यूरोनल संस्कृतियों में अध्ययन नेटवर्क गतिशीलता 1 के लिए किया जा सकता है । पैच-क्लैंपिंग जैसे अधिक पारंपरिक तरीकों के विपरीत, जो केवल एक सेल से गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकता है, या एक गिलास विंदुक के साथ क्षेत्रीय रिकॉर्डिंग को रिकॉर्ड कर सकता है, जो कि एक ही साइट पर इलेक्ट्रोड के न्यूरॉन्स से बाहरी प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड कर सकता है-MEAs एक साथ प्रत्येक इलेक्ट्रोड को व्यक्तिगत रूप से रखने के कठिन काम की आवश्यकता के बिना सेल संस्कृति में कई साइटों से रिकॉर्ड। इससे उस संस्कृति के भीतर एक नेटवर्क बनाने वाली कोशिकाओं के समूह के बीच गतिशील परस्पर क्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति मिलती है। इसके अलावा, नेटवर्क फायरिंग पैटर्न 2 , 3 , 4 , 5 और नेटवर्क नियंत्रण 6 < पर इलेक्ट्रिकल उत्तेजना के प्रभाव/ Sup> neuronal संस्कृतियों में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, और बिजली उत्तेजना और नियंत्रण के कई विन्यास आसानी से एक ही प्रयोगात्मक सेटअप के भीतर लागू किया जा सकता है, जिससे पता लगाया जा सके कि स्थूल-अस्थायी गतिशीलता की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति दी जा सकती है।
इन इन विट्रो अध्ययनों में दिलचस्पी की प्रमुख गतिशीलता में से एक यह है कि किस सुव्यवस्थित नेटवर्क में प्रदर्शित गुण 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 का संकेत मिलता है। Peixoto लैब ने पहले उच्च आवृत्ति प्रशिक्षण संकेतों के प्रभाव की जांच की, जैसा कि रूरो एट अल में वर्णित है 14 , माउस न्यूरॉन्स के नेटवर्क पर, माइक्रोइलेक्ट्रोडेड एरे 15 पर चढ़ाया गया इन प्रयोगों में, नेटवर्क ने प्रतिक्रिया के बाद में वृद्धि को प्रदर्शित कियाविद्युत उत्तेजना द्वारा प्रेरित जी प्रशिक्षण वृद्धि की प्रतिक्रिया उत्तेजना मान्यता के माध्यम से सीखने का एक रूप माना जाता था, जिससे नेटवर्क विशिष्ट उत्तेजना ( यानी, प्रशिक्षण) प्रोटोकॉल के आवेदन के बाद उत्तेजना में बदलाव के लिए एक सुसंगत तरीके से जवाब दिया।
इस प्रोटोकॉल में यह दर्शाता है कि विदेश मंत्रालय के संस्कृति तंत्रिका कोशिकाएं 95% से अधिक मढ़वाया व्यंजनों से सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करती हैं, नेटवर्क को उत्तेजना के पैटर्न पर प्रतिक्रिया देने के लिए एक एकल प्रोटोकॉल की स्थापना करती है, एकल एकल इकाई की गतिविधि, साजिश हिस्टोग्राम सॉर्ट करता है, और परिणामों से व्याख्या करता है ऐसे प्रयोग न्यूरोनल संस्कृतियों के उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वामित्व प्रणाली का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें), साथ ही साथ न्यूरॉनल इकाइयों को सॉर्ट करने के लिए सॉफ़्टवेयर संकुल के आवेदन (सामग्री की तालिका देखें) का प्रदर्शन किया जाता है कस्टम-डिज़ाइन ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस (देखें सामग्री की सारणी ) का उपयोग पोस्ट-एस को देखने के लिए किया जाता हैसमयबद्ध हिस्टोग्राम, अंतर-फट अंतराल, और फट अवधि, साथ ही एक प्रशिक्षण प्रोटोकॉल से पहले और बाद में उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की तुलना करना
इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित कदम विदेशों के लिए प्लेटफॉर्म पर अपनी न्यूरोनल संस्कृतियों की शुरुआत करने के लिए और नेटवर्क गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त विवरण प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि संस्कृतियां ठीक से पालन करती हैं, इलेक्ट्रोड सरणियों पर कोशिकाओं के कालीन परत का निर्माण करती है, और महीनों के लिए स्वस्थ और दूषित-मुक्त रहती हैं।
यद्यपि प्रोटोकॉल के सभी हिस्सों का पालन करना सबसे अच्छा है, लेकिन सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में कदम हैं। पूरी प्रक्रिया में सड़न रोकनेवाला तकनीक का इस्तेमाल संस्कृतियों को दूषित होने से रोकने के लिए आवश्यक है। नए MEAs को हाइड्रोफिलिक बनाया जाना चाहिए, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, या फिर खराब सेल आसंजन का परिणाम होगा। कठोर pipetting और हदबंदी के दौरान हवा के बुलबुले के गठन से बचने क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा और एक उच्च और स्वस्थ उपज के लिए नेतृत्व करेंगे। पहले डीएमईएम 5/5 से डीएमईएम + पर स्विच करनाभोजन भी महत्वपूर्ण है डीएमईएम 5/5 में घोड़ा सीरम होता है, जिससे ग्लियाय कोशिकाएं संस्कृति पर हावी हो सकती हैं अगर लगातार इस्तेमाल की जाती हैं और न्यूरोनल गतिविधि खराब हो जाएगी, हालांकि संस्कृतियां स्वस्थ 17 दिखाई देगी। संस्कृतियों को शेड्यूल किए जाने और उचित इनक्यूबेटिंग स्थितियों में रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है।
विदेश मंत्रालय में चढ़ाना सेल संस्कृतियों में कई चर शामिल हैं जो कम-से-इष्टतम परिणामों तक पहुंच सकते हैं। यद्यपि लक्ष्य कोशिकाओं का एक परिपूर्ण "कालीन" है, हालांकि ऊपर उल्लिखित महत्वपूर्ण चरणों का समाधान करने में विफलता का परिणाम खराब सेल परिपक्वता या दूषित हो जाएगा। खराब सेल आसंजन, जो खराब सेल परिपक्वता से अलग है, यह भी एक चिंता का विषय है। यह कई कारकों के कारण हो सकता है, जिसमें पुरानी माध्यम के प्लेटिंग या उपयोग के पूर्व गरीब विदेश मंत्रालय की तैयारी भी शामिल है। यदि पुराने माध्यम में मस्तिष्क कोशिका संस्कृति के लिए एल-ग्लुटामाइन और सीरम मुक्त पूरक का एक स्थिर रूप है (देखें सामग्री तालिका) का उपयोग किया जाता है, कोशिकाएं शुरू में पालन करती हैं लेकिन फिर लगभग दो हफ्तों के बाद फ्लोट करती हैं। यदि जीवाणु दूषित एक लगातार समस्या है, तो एंटीबायोटिक, जैसे एम्पीसिलीन या पेन-स्ट्रेप, को मध्यम में जोड़ा जा सकता है। फंगल संबंधी प्रदूषण के इलाज के लिए उपलब्ध कवक भी उपलब्ध हैं। ये कुछ अधिक सामान्य चर हैं जो संस्कृतियों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। ऐसे कई अन्य लोग हैं जो केवल समय और अनुभव के बाद ही सामने आएंगे।
ग्लास माइक्रोइलेक्ट्रोड के उपयोग की तुलना में, यह तकनीक नेटवर्क गतिशीलता और औषधीय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट है। यह कई अलग-अलग स्थैतिक-अस्थायी उत्तेजना के पैटर्न के उपयोग को सक्षम करता है और एक ही बार में कई क्षेत्रों से न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। पिछला समूहों ने यहां वर्णित लोगों के समान प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए दिलचस्प परिणाम प्रदर्शित किए हैं। चूंकि संस्कृतियों को सप्ताह या महीनों के लिए पिछले और उसी संस्कृति का पुन: उपयोग किया जा सकता है, इसलिए यह तकनीक भी एक हैएक ही नेटवर्क पर समय के साथ कई प्रयोगों के लिए llows
हालांकि, इस तकनीक की सीमाएँ हैं विदेश मंत्रालय गैर-आक्रामक हैं। इसलिए, वे केवल बाह्य गतिविधियों को रिकॉर्ड कर सकते हैं, जैसा कि पैकेट-क्लैम्पिंग या पिपेटों के साथ इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग के विपरीत है। इसके अलावा, क्योंकि एक सरणी में प्रत्येक इलेक्ट्रोड को कई कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है, एक एकल न्यूरॉन की गतिविधि को हल करना संभव नहीं है। इसके विपरीत, क्योंकि ये इन विट्रो संस्कृतियों में हैं, वे मस्तिष्क में नेटवर्क के संरचनात्मक गुणों को पूरी तरह पुन: पेश नहीं कर सकते। इसके अलावा, गतिविधि को केवल एक समय में 30 मिनट से कम समय तक रिकॉर्ड किया जा सकता है, जो किसी तंत्र को पीएच संतुलन बनाए रखने के लिए कोशिकाओं के लिए सीओ 2 वायुमंडल प्रदान करते हैं।
एक बार इस तकनीक की महारत हासिल हो जाने के बाद, विद्युत उत्तेजना के साथ या बिना औषधीय जोड़तोड़ का पता लगाया जा सकता है। न्यूरॉनल नेटवर्क में सीखने और स्मृति निर्माण की जांच के लिए नए प्रोटोकॉल भी पी के साथ डिज़ाइन और परीक्षण किए जा सकते हैंहिप्पोकैम्पल या रीढ़ की हड्डी के नेटवर्क के लिए रोटोकॉल उत्तेजना और नेटवर्क के प्रशिक्षण के लिए प्रोटोकॉल पहले ही प्रकाशित किए गए हैं, और इनमें से कुछ को विवो प्रोटोकॉल में विकसित किया गया था, जैसे "ऐटान एट अल द्वारा प्रस्तावित" चयनात्मक अनुकूलन " 19 कई प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था। हालांकि, 2005 में रूरो द्वारा प्रस्तावित टेटनस प्रक्रिया में संशोधन के परिणाम केवल 14 , 20 में प्रस्तुत किए गए हैं ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान CMMI-1300007 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पिछले प्रयोगशाला सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं, जिन्होंने इन प्रोटोकॉल के डिजाइन और जॉर्ज मेसन यूनिवर्सिटी में पाँच वर्षों से संस्कृतियों के रखरखाव में मदद की है: डॉ। जोसेफ जे पंक्राजियो, डॉ। हामिद चरखकर, डॉ। ग्रेचेन कनाक , डॉ। फ्रांज हैमिल्टन, माइकल मकेरा, और रॉबर्ट ग्राहम
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |