Çok elektrotlu diziler üzerinde kültürlenen fare nöronal hücreleri, elektrik stimülasyonunu takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, nöronların nasıl kültürlendiğini, aktivitenin nasıl kaydedildiğini ve uyarılma modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için nasıl protokol oluşturacağını gösterir.
Mikro elektrod dizileri (MEA'lar) ilaç toksisitesini araştırmak, yeni nesil kişiselleştirilmiş tıp için tasarım paradigmalarını ve nöronal kültürlerde ağ dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Tek bir hücreden yalnızca aktivite kaydedebilen yama sıkıştırma gibi geleneksel yöntemlerin aksine, ÇÇ'lar, her bir elektrodun ayrı ayrı yerleştirilmesi zorlu bir görev gerektirmeden, bir ağdaki birden çok alandan aynı anda kayıt yapabilir. Dahası, çok sayıda kontrol ve uyarılma konfigürasyonu, aynı deneysel kurulumda kolayca uygulanabilir ve geniş bir dinamik aralığı keşfedilebilir. Bu in vitro araştırmalarda ilgi çekici anahtar dinamiklerden biri, kültürlü şebekelerin öğrenme göstergesinin özelliklerini ne ölçüde sergilediğidir. MEA'lar üzerinde kültüre edilen fare nöronal hücreleri, elektrik uyarımı ile indüklenen eğitimi takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, ÇKA'lardaki nöronal hücrelerin nasıl kültive edileceğini gösterir; Başarıyla tekrarKaplamalı tabakların% 95'inden fazla kablo; Teşvik modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için bir protokol oluşturun; Ve bu tür deneylerden elde edilen sonuçları sıralayabilir, arsa ve yorumlayabilir. Nöronal kültürlerin uyarılması ve kaydedilmesi için tescilli bir sistem kullanılması gösterilmiştir. Yazılım paketleri ayrıca nöronal üniteleri sıralamak için kullanılır. Özel uyarlanmış bir grafik kullanıcı arabirimi, uyarı sonrası zaman histogramlarını, kesintisiz aralıklarla ve patlamanın süresini görselleştirmenin yanı sıra, bir eğitim protokolü öncesi ve sonrasında uyarıya hücresel yanıtı karşılaştırmak için kullanılır. Son olarak, bu araştırma çabasının temsili sonuçları ve gelecekteki yönleri tartışılmaktadır.
Mikro elektrot dizileri (MEA'lar) ilaç toksisitesini araştırmak, yeni nesil kişiselleştirilmiş tıp için tasarım paradigmalarını ve nöronal kültürlerde ağ dinamikleri incelemek için kullanılabilir 1 . Yalnızca tek bir hücreden aktiviteyi kaydedebilen ya da elektrodu tek bir alanda çevreleyen nöronlardan hücre dışı tepkileri kaydedebilen cam pipetle alan kaydı gibi daha geleneksel yöntemlerin aksine, MEA'lar aynı anda Her elektrotu tek tek yerleştirmenin zorlu görevini gerektirmeden hücre kültüründe birden fazla bölgeden kayıt yapabilirsiniz. Bu, o kültür içinde bir ağ oluşturan hücreler grubu arasındaki dinamik etkileşimlerin çalışılmasına olanak tanır. Ayrıca, 2 , 3 , 4 , 5 şebeke ateşleme modelleri ve şebeke kontrolü için elektriksel uyarıların etkisi 6 </ Sup> nöronal kültürlerde iyi belgelenmiştir ve sayısız konfigürasyon elektrik stimülasyonu ve kontrolleri, aynı deney düzeneğinde kolayca uygulanabilir ve geniş bir aralıktaki uzaysal-zamansal dinamiklerin araştırılmasına izin verilir.
Bu in vitro araştırmalarda ilgi çekici anahtar dinamiklerden biri, kültürlü şebekelerin öğrenmeyi gösteren özellikleri gösteren 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 olmuştur. Peixoto Laboratuarı daha önce, yüksek frekanslı eğitim sinyallerinin etkilerini Ruaro ve ark. 14 , mikroelektrod dizilerine kaplanmış fare nöronlarının ağlarında 15 . Bu deneylerde, şebekeler yanıt izlemede artış gösterdiElektriksel uyarım ile indüklenen g eğitimi. Artan tepki, uyarıcı tanıma yoluyla öğrenme biçimi olarak kabul edildi; ağlar belirli bir uyarı ( örn., Eğitim) protokolünün uygulanmasından sonra uyarandaki bir değişime tutarlı bir şekilde yanıt verdi.
Bu protokol, ÇÇ'larda nöronal hücrelerin nasıl kültürlendiğini, kaplanan yemeklerin% 95'inden başarıyla kaydedildiğini, uyarı modellerine cevap vermek için ağları eğitmenin, tek üniteli aktiviteleri sıralamanın, histogramların çizilmesini ve sonuçların nasıl yorumlanacağını gösteren bir protokol oluşturmayı göstermektedir. Böyle deneyler. Nöronal kültürlerin uyarılması ve kaydedilmesi için tescilli bir sistemin kullanılması ( Malzeme Tablosuna bakınız ) yanı sıra, nöronal üniteleri sıralamak için yazılım paketlerinin uygulanması (Malzemelerin Tablosuna bakınız ) gösterilmiştir . Özel tasarlanmış bir grafik kullanıcı arabirimi (Malzeme Tablosuna bakınız) post-s'leri görselleştirmek için kullanılırTimulus zamanı histogramları, inter-burst aralıkları ve patlamanın süresini belirlemek ve ayrıca bir antrenman protokolü öncesi ve sonrasında uyarıya hücresel cevabı karşılaştırmak için kullanılmıştır.
Bu protokolde özetlenen adımlar, yeni başlayanlar için kendi nöronal kültürlerini ÇÇ'lar üzerine yerleştirip ağ etkinliklerini kaydetmek için yeterli ayrıntı sağlar. Bu protokol, kültürlerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamaya, elektrot dizileri üzerinde bir halı hücre tabakası oluşturmaya ve aylardır sağlıklı ve kirletici olmamasına yardımcı olacaktır.
Protokolün tüm bölümlerine uymak en iyisi olsa da, süreç boyunca başarılı sonuç için kritik öneme sahip adımlar vardır. Tüm süreç boyunca aseptik tekniğin kullanılması, kültürlerin kontamine olmasını önlemek için zorunludur. Yeni ÇÇA'lar, protokolde tarif edildiği gibi hidrofil hale getirilmelidir veya yoksul hücre yapışması ortaya çıkar. Ayrıştırma sırasında sert pipetleme ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek, hasar gören hücrelerin sayısını azaltacak ve daha yüksek ve daha sağlıklı bir verim sağlayacaktır. İlk önce DMEM 5/5'ten DMEM +'ye geçmeBeslenme de önemlidir. DMEM 5/5 at serumu içerir; bu, eğer glial hücrelerin devamlı kullanılması halinde kültüre egemenlik kazandıracak ve kültürler zayıf nöronal aktiviteye neden olacaktır, ancak kültürler sağlıklı görünecektir 17 . Kültürleri planlandığı gibi besleme ve bunları uygun kuluçka koşullarında tutmak da çok önemlidir.
ÇÇA'larda hücre kültürlerinin plaklanması, optimal sonuçların altında kalmasına neden olabilecek birçok değişkeni içerir. Hedef, hücrelerin mükemmel bir "halı" olmasına rağmen, yukarıda bahsedilen kritik adımları atlama başarısızlığı yetersiz hücre olgunlaşması veya bulaşma ile sonuçlanır. Fakir hücre adezyonu, fakir hücre olgunlaşmasından farklıdır, aynı zamanda bir endişe kaynağıdır. Bunun nedeni, kaplamadan önce zayıf MEA hazırlığı veya eski ortamın kullanılması da dahil olmak üzere birçok faktörden kaynaklanabilir. Eğer nöral hücre kültürü için stabilize edilmiş L-glutamin ve serum içermeyen bir form içeren eski ortam varsa (bkz. Malzeme Tablosu) Kullanılır, hücreler başlangıçta yapışır, ancak yaklaşık iki hafta sonra kaybolurlar. Bakteri kontaminasyonu kalıcı bir sorundaysa, ampisilin veya kalem strep gibi bir antibiyotik ortama ilave edilebilir. Mantar kontaminasyonunu tedavi etmek için mevcut fungisitler de mevcuttur. Bunlar, kültürlerin sonucunu etkileyebilecek daha yaygın değişkenlerden bazılarıdır. Yalnızca zaman ve deneyim sonrasında karşılaşılacak diğer pek çok şey vardır.
Cam mikroelektrodlarının kullanımıyla kıyaslandığında, bu teknik ağ dinamikleri ve farmakolojik cevapların incelenmesi için mükemmeldir. Birçok farklı uzaysal ve zamansal uyarılma modelinin kullanılmasını sağlar ve aynı anda birden çok bölgedeki nöronal yanıtların kaydedilmesini sağlar. Önceki gruplar burada açıklananlara benzer protokoller kullanarak ilginç sonuçlar verdi 18 . Kültürler hafta veya ay sürer ve aynı kültürler tekrar kullanılabilir olduğundan, bu teknik aynı zamandaAynı ağ üzerinde zamanla çoklu denemeler için geçerlidir.
Bununla birlikte, bu tekniğin sınırları vardır. ÇÇA'lar invaziv değildir. Bu nedenle, yalnızca pipet ile yama tutma veya hücre içi kayıt yerine, hücre dışı aktiviteyi kaydedebilirler. Dahası, bir dizideki her elektrod birkaç hücre ile kaplandığından, tek bir nöronun etkinliğini çözmek mümkün değildir. Tersine, bunlar in vitro kültürler olduğundan, beyindeki ağların yapısal özelliklerini tam olarak üretemezler. Ayrıca, aktivite, hücrelerin pH dengesini korumak için CO2 atmosferi sağlayan bazı mekanizmalar olmaksızın, aynı anda 30 dakikadan az sürede kaydedilebilir.
Bu tekniğe hakim olunca, elektrik stimülasyonlu veya elektriksel uyarı olmadan farmakolojik manipülasyonlar araştırılabilir. Nöronal ağlarda öğrenmeyi ve hafıza oluşumunu araştıran yeni protokoller de birlikte tasarlanabilir ve test edilebilirHipokampal veya omurilik ağları için rotokolatlar. Şebekelerin teşvik edilmesi ve eğitimi için protokoller daha önce yayınlanmış ve bunlardan bazıları, Eytan ve diğerleri tarafından önerilen "seçici adaptasyon" gibi in vivo protokollerle daha da geliştirilmiştir . 19 . Birkaç protokol test edildi. Bununla birlikte, sadece burada 2005 yılında Ruaro tarafından önerilen tetanoz prosedürüne yapılan bir değişiklik 14,20'de sunulmuştur.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı hibe CMMI-1300007 tarafından finanse edildi. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack, bu protokollerin tasarımında yardımcı olan önceki laboratuar üyelerini ve beş yıldan uzun süre boyunca kültürlerin bakımını George Mason Üniversitesi'nde kabul etmek istiyoruz. , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera ve Robert Graham.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |