Real-time Iontophoresis med tetrametylammonium for å kvantifisere volumfraksjon og tortuositet i hjernens ekstracellulære rom

Summary

Denne protokollen beskriver sanntids-iontoforese, en metode som måler fysiske parametere for det ekstracellulære rommet (ECS) av levende hjerner. Spredningen av et inert molekyl som slippes i ECS, brukes til å beregne ECS volumfraksjonen og tortuositeten. Det er ideelt for å studere akut reversible endringer i hjerne ECS.

Abstract

Denne anmeldelsen beskriver de grunnleggende konseptene og protokollen for å utføre realtids iontoforese-metoden (GI), gullstandarden for å undersøke og kvantifisere det ekstracellulære rommet (ECS) av levende hjerne. ECS omgir alle hjerneceller og inneholder både interstitiell væske og ekstracellulær matrise. Transport av mange stoffer som kreves for hjernens aktivitet, inkludert nevrotransmittere, hormoner og næringsstoffer, skjer ved diffusjon gjennom ECS. Endringer i volum og geometri i dette rommet forekommer under normale hjerneprosesser, som søvn og patologiske forhold, som iskemi. Men strukturen og reguleringen av hjernen ECS, særlig i sykdommer, forblir stort sett uutforsket. RTI-metoden måler to fysiske parametere av levende hjerne: volumfraksjon og tortuositet. Volumfraksjon er andelen av vevvolumet okkupert av ECS. Tortuosity er et mål på den relative hindringen et stoff møter når det diffunderes gjennom hjernenGion i forhold til et medium uten hindringer. I RTI pulses et inert molekyl fra en kilde-mikroelektrode til hjernen ECS. Som molekyler diffunderer vekk fra denne kilden, måles den skiftende konsentrasjonen av ionet over tid ved å bruke en ion-selektiv mikroelektrode plassert omtrent 100 μm unna. Fra den resulterende diffusjonskurven kan både volumfraksjon og tortuositet beregnes. Denne teknikken har blitt brukt i hjerneskiver fra flere arter (inkludert mennesker) og in vivo for å studere akutte og kroniske endringer i ECS. I motsetning til andre metoder kan RTI brukes til å undersøke både reversible og irreversible endringer i hjernens ECS i sanntid.

Introduction

Det ekstracellulære rommet (ECS) er nettverket av sammenkoblede kanaler utvendig til alle hjerneceller og inneholder både interstitialvæske og ekstracellulær matrise ( figur 1a og figur 1b ). Fordelingen av mange stoffer som kreves for hjernecellens funksjon, inkludert næringsstoffer, hormoner og nevrotransmittere, oppstår ved diffusjon gjennom ECS. Endringer i de fysiske parametrene til dette rommet, inkludert volum, geometri og ekstracellulær matrise, kan drastisk påvirke diffusjon gjennom ECS og de lokale ionkonsentrasjonsbadinghjerneceller, som har en dyp innvirkning på hjernecellens funksjon ^{1 , 2} .

Real-time iontophorese (RTI) brukes til å bestemme to strukturelle egenskaper i en hjerneområde: volumfraksjon og tortuosity ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. Volumfraksjon ( α ) er andelen av vevvolum okkupert av ECS ( V _ECS ) i forhold til totalvevvolumet ( V- _vev ) i et representativt elementært volum;

Tortuosity ( λ ) er den relative hindringen som et stoff møter når det diffunderer gjennom en hjerneområde i forhold til et medium uten hindringer;

Hvor D ^* (cm ² s ^-1 ) er den effektive diffusjonskoeffisienten av stoffet i hjernen og D (cm ² s ^-1 ) er den frie diffusjonskoeffisienten av stoffet i et fritt medium, slik som fortynnet agarosegel.

I dag er den mest brukte probesubstansen for RTI-metoden er den lille kationtetrametylammonium (TMA). TMA har en molekylvekt på 74 g / mol, dissocieres fullstendig i oppløsning, og har en positiv ladning. RTI studier med dette ionet har vist at α 0,2 og λ 1,6 ^{1 , 2} . Dette betyr at ECS er omtrent 20% av total hjernevolum, og at diffusjonen av et lite inert molekyl forekommer omtrent 2,5 ganger langsommere i ECS enn i et medium uten hindringer ³ . Imidlertid varierer både a og λ med hjernealder, region og tilstand og i patologiske forhold ¹ . Endringer av disse parametrene har vært knyttet til hjernens utvikling, aldring, søvn, epilepsi og mange andre grunnleggende prosesser og sykdommer i hjernen ^{1, 6} . Mens andre teknikker måler α og λ , kan RTI måle både i lokaliserte områder av levende vev i sanntid. Av denne grunn har RTI blitt et uunnværlig verktøy for å undersøke endringer i a og λ under akutte og reversible utfordringer.

Teorien som støttet RTI ble opprinnelig godkjent av Nicholson og Phillips, og teknikken har blitt brukt mye siden den tiden ^{4 , 7} . Eksperimenter som benytter RTI begynner med frigjøring av en puls av TMA fra en kilde-mikroelektrode ved iontoforese inn i en fortynnet agarosegel. Når de er utkastet, diffunger ioner fritt fra punktkilden, og velger fra et potensielt uendelig antall tilfeldige veier ( figur 1d ). Den endrede konsentrasjonen av ionet måles over tid ved å bruke en jon-selektiv mikroelektrode (ISM) plassert grovt100 μm unna ( figur 1c ). Endringene i TMA-konsentrasjonen er grafet og montert på en kurve som gjør det mulig å beregne både D og transportnummeret til iontoforese mikroelektroden (parametere diskutert i protokollen). Med disse verdiene gjentas prosedyren i en hjerneområde av interesse for å oppnå D ^* og å beregne både a og λ . Kontroll av iontophorese mikroelektroden, datainnsamling, grafing og montering av TMA-konsentrasjonskurven og beregning av eksperimentelle parametere gjøres vanligvis av programmene Wanda and Walter, som er spesielt designet for dette formålet (programvaren og deres håndbøker er Fritt tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel).

Protokolldelen i denne anmeldelsen beskriver de grunnleggende prosedyrene som trengs for å designe og utføre RTI i hjerneskjær av gnagere. Teknikken har også blitt brukt i ikke-stangEnt modeller, inkludert humane hjerne skiver og in vivo hjernen preparater ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Den Representative Results-delen inneholder både ideelle og ikke-ideelle resultater for å markere nyanser i datatolkning. Endelig dekker diskusjonsseksjonen feilsøkingsteknikker, begrensninger av RTI, alternative teknikker som brukes til å studere ECS, og fremtidige applikasjoner av RTI.

Figur 1: Diagrammer av diffusjon gjennom ECS. ( A ) Diagram over ECS: Demonstrer størrelsen og plasseringen av ECS i en typisk hjerneseksjon. Gul markerer ECS mellom de grå hjernecelleprosessene. Volumet av ECS er omtrent 20% av det totale vevvolumet ( dvs. volumfraksjon = 0.2) under fysiologiske forhold. ( B ) Forstørret diagram av ECS: Fremhever fysiske parametre som bidrar til tortuositet, inkludert hjernecellet geometri (grå) og ekstracellulær matrise (diagrammet som et maske av flerfarget glykosaminoglykaner og proteoglycaner). ( C ) 3D-diagram av diffusjon fra en punktkilde: Demonstrerer netto bevegelse av inerte molekyler fra en iontoforetisk kilde til en ISM. Uten diffusjonsbarrierer og opptak av cellene diffunderer molekylene utover i alle retninger, og produserer en sfærisk konsentrasjonsfront. ISM kvantifiserer den lokale konsentrasjonen av de inerte molekylene frigjort fra den iontoforetiske kilden. ( D ) Datasimulering av diffusjon i hjernens ECS: [Langt til venstre] Oppsett for Monte Carlo-simulering; Grønne sfærer representerer hjernecelleprosesser og det røde kors representerer en punktkilde. Dette oppsettet modellerer hjernevævet diagrammet i figur 1a . [Midtbilder] 3 og6 molekyler utfører tilfeldige bevegelser som de diffunderer gjennom hjernens ekstracellulære rom, vist i 2 dimensjoner. [Langst til høyre] Tilfeldige turer av mange molekyler utgitt fra punktkilden. Netto bevegelse av alle molekyler fra punktkilden er utover som vist i figur 1c . De kumulative tilfeldige turene skisserer mellomromene mellom cellene ( dvs. ECS, se referanse ⁵ for videre forklaring). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle dyreprosedyrer, som brukes til å oppnå vevsprøver, ble godkjent av dyreetikkutvalget ved SUNY Downstate Medical Center. 1. Fremstilling av løsninger og utstyr Klargjør en 150 mM NaCl-fyllingsløsning for referansekranen til ISM. Oppbevar den i en 10 ml sprøyte festet til et 0,22 μm filter (for å fjerne bakterier eller partikler). Forbered en 150 mM TMA klorid (TMA-Cl) påfyllingsløsning for mikroelektroder. Oppbevar den i en 10 ml sprøyte festet til et 0,2…

Representative Results

Utnyttelsen av RTI-teknikken er demonstrert i et eksperiment designet for å måle endringene i a og under en hypoosmolær utfordring ( figur 8 og figur 9 ). Det har tidligere blitt vist at redusering av osmolariteten til ECS ved vask på hypotonisk ACSF vil gi en reduksjon i α og en økning i λ 13 . I dette forsøk…

Discussion

Figur 10: Ikke-ideelle data som demonstrerer vanlige tekniske problemer. ( A ) Diagrammer av vanlige tekniske problemer med iontophores mikroelektroder: Sammenligning av normal frigivelse av TMA fra en fungerende iontoforese mikroelektrode med tre kilder som viser tekniske problemer. [Høy forstørrelse, a1] Strømmen i en ideell iontoforetisk kilde bæres like ved TMA-frigivelse og kloridopptak. [H…

Materials

A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm)
objective 5x dry	Olympus	MPlan N
objective 10x water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description