Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello

Summary

Questo protocollo descrive la iontoforesi in tempo reale, un metodo che misura i parametri fisici dello spazio extracellulare (ECS) dei cervelli viventi. La diffusione di una molecola inerte rilasciata nell'ECS viene usata per calcolare la frazione del volume ECS e la tortuosità. È ideale per studiare cambiamenti reversibili acuti al cervello ECS.

Abstract

Questa revisione descrive i concetti base e il protocollo per eseguire il metodo in tempo reale di iontoforesi (RTI), lo standard oro per esplorare e quantificare lo spazio extracellulare (ECS) del cervello vivente. L'ECS circonda tutte le cellule del cervello e contiene sia il liquido interstiziale che la matrice extracellulare. Il trasporto di molte sostanze necessarie per l'attività cerebrale, compresi i neurotrasmettitori, gli ormoni e le sostanze nutritive, avviene per diffusione attraverso la ECS. Le variazioni del volume e della geometria di questo spazio si verificano durante i processi normali del cervello, come il sonno e le condizioni patologiche, come l'ischemia. Tuttavia, la struttura e la regolazione della ECS cerebrale, in particolare negli stati malati, rimangono in gran parte inesplorati. Il metodo RTI misura due parametri fisici del cervello vivente: frazione di volume e tortuosità. La frazione di volume è la proporzione del volume di tessuto occupata da ECS. Tortuosità è una misura della relativa impedenza che una sostanza incontra quando si diffonde attraverso un cervelloGion rispetto ad un mezzo senza ostruzioni. In RTI, una molecola inerte viene pulsata da un microelettrodo di origine nel cervello ECS. Mentre le molecole si diffondono da questa sorgente, la variabile concentrazione dello ione viene misurata nel tempo utilizzando un microelettrodo ionico selettivo posizionato a circa 100 μm di distanza. Dalla curva di diffusione risultante, è possibile calcolare sia la frazione di volume sia la tortuosità. Questa tecnica è stata utilizzata in fette cerebrali di molteplici specie (compresi gli esseri umani) e in vivo per studiare cambiamenti acuti e cronici a ECS. A differenza di altri metodi, RTI può essere utilizzato per esaminare sia cambiamenti reversibili che irreversibili nel cervello ECS in tempo reale.

Introduction

Lo spazio extracellulare (ECS) è la rete di canali interconnessi esterni a tutte le cellule del cervello e contiene sia il liquido interstiziale che la matrice extracellulare ( Figura 1a e Figura 1b ). La distribuzione di molte sostanze necessarie per la funzionalità delle cellule cerebrali, comprese le sostanze nutritive, gli ormoni e i neurotrasmettitori, avviene per diffusione attraverso la ECS. I cambiamenti nei parametri fisici di questo spazio, compresi il volume, la geometria e la matrice extracellulare, possono influenzare drasticamente la diffusione attraverso la ECS e le cellule cerebrali di concentrazione delle ioni locali che hanno un impatto profondo sulla funzione delle cellule cerebrali ^{1 , 2} .

La iontoforesi in tempo reale (RTI) è utilizzata per determinare due caratteristiche strutturali di una regione del cervello: frazione di volume e tortuosità ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. La frazione di volume ( α ) è la proporzione del volume tissutale occupato dall'ECS ( V _ECS ) rispetto al volume totale del tessuto ( _tessuto V ) in un volume elementare rappresentativo;

La tortuosità ( λ ) è l'impedenza relativa che una sostanza incontra quando diffonde attraverso una regione del cervello rispetto ad un mezzo senza ostruzioni;

Dove D ^* (cm ² s ^-1 ) è il efficace coefficiente di diffusione della sostanza nel cervello e D (cm ² s ^-1 ) è il coefficiente di diffusione libera della sostanza in un mezzo libero, come il gel agarosio diluito.

Oggi, la sostanza sonda più comunemente utilizzata per la RIl metodo TI è il piccolo cation tetrametilammonio (TMA). TMA ha un peso molecolare di 74 g / mol, si dissociizza completamente in soluzione e ha una carica positiva. Gli studi di RTI con questo ione hanno dimostrato che α 0,2 e λ 1,6 ^{1 , 2} . Ciò significa che l'ECS è circa il 20% del volume totale del cervello e che la diffusione di una piccola molecola inerte si verifica circa 2,5 volte più lentamente nella ECS che in un mezzo senza ostruzioni ³ . Tuttavia, entrambi α e λ variano con l'età del cervello, la regione e lo stato e nelle condizioni patologiche ¹ . Le alterazioni di questi parametri sono state legate allo sviluppo del cervello, all'invecchiamento, al sonno, all'epilessia e ad altri processi fondamentali e alle malattie del cervello ^{1, 6} . Mentre altre tecniche misurano α e λ , RTI può misurare sia in regioni localizzate del tessuto vivente in tempo reale. Per questa ragione, RTI è diventato uno strumento indispensabile per indagare i cambiamenti in α e λ durante le sfide acute e reversibili.

La teoria che supporta RTI è stata originariamente convalidata da Nicholson e Phillips, e la tecnica è stata ampiamente usata da quel tempo ^{4 , 7} . Gli esperimenti che impiegano RTI iniziano con il rilascio di un impulso di TMA da un microelettrodo di origine mediante iontoforesi in un gel agaroso diluito. Una volta espulsi, gli ioni si diffondono liberamente dalla sorgente di punti, scegliendo da un numero potenzialmente infinito di percorsi casuali ( Figura 1d ). La variabile concentrazione dello ione viene misurata nel tempo utilizzando un microelettrodo ionico-selettivo (ISM) posizionato approssimativamente100 μm di distanza ( figura 1c ). Le variazioni della concentrazione TMA sono grafiche e montate su una curva che permette di calcolare sia il D che il numero di trasporto del microelettrodo ionoforesi (parametri discussi nel Protocollo). Con questi valori, la procedura viene ripetuta in una regione cerebrale di interesse per ottenere D ^* e per calcolare sia α che λ . Il controllo del microelettrodo ionoforesi, la raccolta dei dati, la grafica e l'adattamento della curva di concentrazione TMA e il calcolo dei parametri sperimentali sono tutti tipicamente eseguiti dai programmi Wanda e Walter, che sono stati appositamente progettati per questo scopo (il software ei relativi manuali sono Liberamente disponibile dagli autori su richiesta).

La sezione del protocollo di questa rassegna descrive le procedure di base necessarie per progettare e eseguire RTI nelle fette del cervello di roditore. La tecnica è stata usata anche in non-astaTra cui le fette del cervello umano e le preparazioni cerebrali in vivo ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . La sezione Risultati rappresentativi fornisce sia risultati ideali che non ideali per evidenziare le sfumature nell'interpretazione dei dati. Infine, la sezione Discussione riguarda brevemente tecniche di risoluzione dei problemi, limitazioni di RTI, tecniche alternative utilizzate per studiare l'ECS e future applicazioni di RTI.

Figura 1: Diagrammi di diffusione tramite ECS. (A) Schema di ECS: dimostra la dimensione e la posizione della ECS in una sezione tipica del cervello. Il colore giallo contrassegna l'ECS tra i processi grigi della cervello. Il volume della ECS è circa il 20% del volume totale del tessuto ( cioè, frazione volume = 0.2) in condizioni fisiologiche. ( B ) Schema ingrandito della ECS: evidenzia i parametri fisici che contribuiscono alla tortuosità, compresa la geometria delle cellule cerebrali (grigio) e la matrice extracellulare (schematizzata come una mesh di glicosaminoglicani multicolori e proteoglicani). ( C ) Diagramma 3D della diffusione da una sorgente di punti: dimostra il movimento netto delle molecole inerte da una sorgente ionoforoica ad un ISM. Escludendo le barriere di diffusione e l'assorbimento cellulare le molecole si diffondono verso l'esterno in tutte le direzioni, producendo una parte frontale di concentrazione sferica. L'ISM quantifica la concentrazione locale delle molecole inerte rilasciate dalla fonte iontoforica. ( D ) Simulazione computerizzata della diffusione in ECS del cervello: [Fine a sinistra] Impostazione per la simulazione di Monte Carlo; Le sfere verdi rappresentano i processi delle cellule cerebrali e la croce rossa rappresenta una fonte di punti. Questa impostazione modella il tessuto cerebrale disegnato in Figura 1a . [Immagini medie] 3 e6 molecole che eseguono movimenti casuali in quanto diffondono attraverso lo spazio extracellulare del cervello, mostrato in 2 dimensioni. [Estrema destra] Camminate casuali di molte molecole rilasciate dalla sorgente di punti. Il movimento netto di tutte le molecole dalla sorgente di punti è verso l'esterno come mostrato nella Figura 1c . Le passeggiate casuali cumulative delineano gli spazi tra le celle ( cioè l'ECS; vedere il riferimento ⁵ per ulteriori spiegazioni). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le procedure animali, utilizzate per ottenere campioni di tessuto, sono stati approvati dal comitato di etica animale presso il SUNY Downstate Medical Center. 1. Preparazione di soluzioni e attrezzature Preparare una soluzione di riempimento di 150 mM NaCl per il barile di riferimento dell'ISM. Conservarlo in una siringa da 10 ml attaccata ad un filtro da 0,22 μm (per rimuovere batteri o particelle). Preparare una soluzione di riempimento di 150 mM TMA cloruro…

Representative Results

L'utilità della tecnica RTI è dimostrata in un esperimento progettato per misurare i cambiamenti in α e durante una sfida ipoosmolare ( Figura 8 e Figura 9 ). È stato precedentemente dimostrato che ridurre l'osmolarità del ECS mediante lavaggio su ACSF ipotonico produrrà una diminuzione di α e un aumento di λ 13 . <p class="jove_content" fo:keep-together.with…

Discussion

Figura 10: Dati non ideali che dimostrano problemi tecnici comuni. (A) Schemi di problemi tecnici comuni con microelettrodi ionoforesi: Confronto tra il normale rilascio di TMA da un microelettrodo funzionamento ionoforesi con tre fonti che dimostrano problemi tecnici. [Elevata ingrandimento, a1] La corrente in una sorgente ionoforica ideale viene trasportata ugualmente da rilascio di TMA e assorbi…

Materials

A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm)
objective 5x dry	Olympus	MPlan N
objective 10x water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description