Summary

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

Published: June 15, 2017
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Summary

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス( すなわち、トランスジーンのランダム組込み)およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。

Abstract

遺伝子改変マウスの使用は、生理学的および病理学的インビボプロセスの両方に関する研究に有意に寄与している 。受精卵母細胞へのDNA発現構築物の前核注入は、過剰発現のためのトランスジェニックマウスを生成するために最も一般的に使用される技術のままである。遺伝子標的化のためのCRISPR技術の導入により、受精した卵母細胞への前核注入は、ノックアウトマウスとノックインマウスの両方に拡大されている。この研究は、注射用DNAの調製と、遺伝子ターゲッティングのためのCRISPRガイドの作成について記述しており、特に品質管理を重視しています。潜在的な創始者の同定に必要な遺伝子型決定手順は重要である。本明細書では、CRISPRの「多重化」能力を利用する革新的な遺伝子型決定戦略を提示する。手術手順も概説されている。一緒に、プロトコルのステップは、世代の生成を可能にする免疫学、神経科学、癌、生理学、発達およびその他を含む多数の研究分野のためのマウスコロニーのその後の確立のために使用される。

Introduction

脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。

今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった(2002)私(2003)。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル(受精から離乳までの6週間)、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色(交差戦略に必要)などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。特に、現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました3

遺伝子移入技術は、ウイルスの送達を用いて最初に作製された30年前の4年にわたる最初のトランスジェニックマウスの作製をもたらした4 。しかし、研究者はすぐに、マウスの遺伝子導入の主な課題の1つは、外因性DNAの運命を制御することができないことに気付いた。マウス卵母細胞へのトランスジーンのウイルス送達により、ゲノムに無作為に組み込まれた複数のコピーが得られたため、その後のトランスジェニック系統の樹立は限られていた。

このような制限の1つは、Gordon et al。マイクロインジェクション5,6で最初のトランスジェニックマウス系統を作製した。これは組換えDNA技術の時代を迎え、マイクロインジェクションセッションの成果に影響を及ぼすパラメータは広く研究されています7 。マイクロインジェクションは、導入遺伝子の組み込み部位(最終的に各創始マウスの特異的発現レベルをもたらす)の制御を可能にしないが、前核ミクロインジェクションの主な利点は、コンカテマー( すなわち、トランスジーンの複数のコピーのアレイ、ゲノムインテグレーションの前に直列にリンクされている。この特徴は、関心のある遺伝子を過剰発現する何千ものトランスジェニックマウス系を確立するために長年にわたって用いられてきた。それ以来、遺伝子組み換えは、生物のゲノムの人工改変は、疾患の発生における単一の遺伝子の役割を同定するために広く用いられてきた。

Mario Capecchiが成功裏にマウスの単一の遺伝子を破壊し、遺伝子ターゲティングの時代を切り開いたときに、マウスゲノムを操作する上でのさらなる成果が達成されました8 。しかし、ES細胞の培養、キメラの程度の変化、およびプロセスの長さ( すなわち、マウスを得るために最小12〜18ヶ月)を含む、ES細胞に基づく遺伝子標的化から急速に大きな欠点が浮かび上がった。

最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、および規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列(CRISPR / Cas9)のような工学エンドヌクレアーゼのような新技術の進歩が、マイクで遺伝子ターゲティングのプロセスを加速するe 9,10 。これらのエンドヌクレアーゼは、マイクロインジェクションによってマウス卵母細胞に容易に注射することができ、わずか6週間で遺伝子標的マウスを作製することができる。

ゲノム編集11のためのCRISPRの使用に関する最初の報告以来、この細菌適応免疫系は、合成の容易さおよび複数の座を一度に標的とする能力を含む多くの利点のために、ZFNおよびTALENに取って代わられた(「多重化")。 CRISPRは、マウス12の遺伝子標的化に初めて使用され、以来、植物からヒトへの無数の種に適用されている13,14 。現在までに、CRISPRゲノム編集に耐性のある単一種の報告はない。

トランスジェニックマウスの作製の2つの主要な制限段階は、卵母細胞の注入および再移植これらの卵母細胞を疑似妊娠した雌に分けた。この技術は我々 15およびその他16によって記載されているが、マウス発生学および遺伝子導入技術における最近の技術的改良は、遺伝子組み換えマウスの作製プロセスに革命をもたらした。これらの改良についてはここで説明する。

Protocol

すべての手続きは、ニューサウスウェールズ州動物衛生倫理委員会の承認を受けています。 導入遺伝子の調製(ランダム・インテグレーション) 分析用アガロースゲル電気泳動。 製造業者の推奨に従ってサーモサイクラー中で適切な酵素(1時間インキュベーション)または高速消化酵素(15〜30分間インキュベーション)を用いて導入遺伝子?…

Representative Results

以下に、ランダム組込みおよびCRISPR媒介遺伝子標的化の場合のマイクロインジェクションのワークフローを示す( 図1 )。 図1:遺伝的に改変されたマウスの典型的なワークフローランダム組み込みのために、精製された?…

Discussion

プロトコル内の重要なステップ

遺伝子組み換えマウスの作製は技術的に困難であることが知られている。しかし、ここで提示されたプロトコルは、記録的な時間に技術をマスターし、トラブルシューティングを行うことを可能にする、最適化され単純化された方法である。この技法をうまく完了するためには、2つのステップが必要である。第一に、線状DNA鋳型(sgRNAの合成…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、継続的な支援のために動物施設(BRC)のスタッフに感謝しています。この研究は、国家保健医療研究評議会とオーストラリア研究評議会によって資金提供された。

Materials

Micropipette 0.1-2.5 ul Eppendorf 4920000016
Micropipette 2-20 ul Eppendorf 4920000040
Micropipette 20-200 ul Eppendorf 4920000067
Micropipette 100-1000 ul Eppendorf 4920000083
Molecular weight marker  Bioline BIO-33025 HyperLadder 1kb
Molecular weight marker  Bioline BIO-33056 HyperLadder 100 bp
Agarose Bioline BIO-41025
EDTA buffer Sigma-Aldrich 93296 10x – Dilute to 1x
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
SYBR Safe gel stain Invitrogen S33102
Gel extraction kit Qiagen 28706
PCR purification kit (Qiaquick) Qiagen 28106
Vacuum system (Manifold) Promega A7231
Nuclease-free microinjection buffer  Millipore MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter  Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNA Sigma-Aldrich CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330) Addgene 42230
Nuclease free water Sigma-Aldrich W4502
Phusion polymerase New England Biolabs M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit New England Biolabs E2050S
RNA purification spin columns (NucAway) Thermo Fisher Scientific AM10070
ssOligos Sigma-Aldrich OLIGO STANDARD
Donor plasmid Thermo Fisher Scientific GeneArt
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
KSOMaa embryo culture medium Zenith Biotech  ZEKS-100
Mineral oil Zenith Biotech  ZSCO-100
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Mouthpiece Sigma-Aldrich A5177
Glass microcapillaries Sutter Instrument BF100-78-10
Proteinase K Applichem A3830.0100
Dumont #5 forceps Fine Science Tools  91150-20
Iris scissors Fine Science Tools  91460-11
Vessel clamp Fine Science Tools  18374-43
Wound clips  Fine Science Tools  12040-01
Clips applier  Fine Science Tools  12018-12
Micro-scissors  Fine Science Tools  15000-03
Cauterizer Fine Science Tools  18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) Ethicon 1691H
5% CO2 incubator MG Scientific Galaxy 14S
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c
Thermocycler Eppendorf 6321 000.515
Electrophoresis set up BioRad 1640300
UV Transilluminator BioRad 1708110EDU
Thermocycler Eppendorf 6334000069
Stereoscopic microscope Olympus SZX7
Inverted microscope Olympus IX71
2x Micromanipulators Eppendorf 5188000.012
Oocytes manipulator Eppendorf 5176000.025
Microinjector (Femtojet) Eppendorf 5247000.013
Mice C57BL/6J strain Australian BioResources C57BL/6JAusb 

References

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Cite This Article
Delerue, F., Ittner, L. M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes. J. Vis. Exp. (124), e55765, doi:10.3791/55765 (2017).

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