Summary

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Published: June 15, 2017
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Summary

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Abstract

Die Verwendung von genetisch veränderten Mäusen hat wesentlich zu Studien an physiologischen und pathologischen In-vivo- Prozessen beigetragen. Die nukleare Injektion von DNA-Expressionskonstrukten in befruchtete Oozyten bleibt die am häufigsten verwendete Technik, um transgene Mäuse für die Überexpression zu erzeugen. Mit der Einführung der CRISPR-Technologie für das Gen-Targeting wurde die nukleare Injektion in befruchtete Oozyten auf die Erzeugung von Knockout- und Knockin-Mäusen ausgedehnt. Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von DNA für die Injektion und die Generierung von CRISPR-Guides für das Gen-Targeting mit besonderem Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle. Die für die Identifikation von potentiellen Gründern erforderlichen Genotypisierungsverfahren sind entscheidend. Innovative Genotypisierungsstrategien, die die "Multiplexing" -Fähigkeiten von CRISPR nutzen, werden hier vorgestellt. Auch chirurgische Verfahren werden skizziert. Gemeinsam werden die Schritte des Protokolls die Erzeugung von Gen ermöglichenEtikodisch modifizierte Mäuse und für die anschließende Etablierung von Mauskolonien für eine Fülle von Forschungsfeldern, einschließlich Immunologie, Neurowissenschaften, Krebs, Physiologie, Entwicklung und andere.

Introduction

Tiermodelle, sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen, waren maßgeblich für die Untersuchung der Pathophysiologie menschlicher Zustände wie der Alzheimer-Krankheit 1 , 2 . Sie sind auch unschätzbare Werkzeuge, um nach Krankheitsmodifikatoren zu suchen und letztlich neue Behandlungsstrategien in der Hoffnung auf eine Heilung zu entwickeln. Obwohl jedes Modell intrinsische Einschränkungen hat, ist die Verwendung von Tieren als ganze systemische Modelle für die biomedizinische Forschung unerlässlich. Denn die metabolische und komplexe physiologische Umgebung kann nicht vollständig in der Gewebekultur simuliert werden.

Bis heute bleibt die Maus die häufigste Säugetierart, die für die genetische Manipulation verwendet wird, da sie mehrere Vorteile aufweist. Die physiologischen Prozesse und Gene, die mit Krankheiten assoziiert sind, sind zwischen Mäusen und Menschen hoch konserviert. Die Maus war der erste Säugetier, um sein volles Genom sequenziert zu haben (2002), ein Jahr vor dem menschlichen GenoIch (2003). Abgesehen von diesem Reichtum an genetischer Information hat die Maus gute Zuchtkapazitäten, einen schnellen Entwicklungszyklus (6 Wochen von der Befruchtung bis zur Entwöhnung) und eine vernünftige Größe. Alle diese Vorteile, verbunden mit physiologischen Indikatoren, wie unterschiedliche Fellfarben (erforderlich für Crossing-Strategien), machte die Maus ein attraktives Modell für die genetische Manipulation. Vor allem in der frühen Zeit der modernen Genetik begann Gregor Mendel, an Mäusen zu arbeiten, bevor er zu Pflanzen ging 3 .

Gentransfer-Techniken führten zur Erzeugung der ersten transgenen Maus über drei Jahrzehnte her 4 , die anfänglich mit viraler Verabreichung hergestellt wurde. Allerdings erkannten die Forscher bald, dass eine der Hauptaufgaben der Maus-Transgenese die Unfähigkeit war, das Schicksal der exogenen DNA zu kontrollieren. Weil die virale Abgabe von Transgenen in Maus-Oozyten dazu geführt hat, dass mehrere Kopien zufällig in das Genom integriert wurden, die MöglichkeitY der Herstellung nachfolgender transgener Linien war begrenzt.

Eine solche Einschränkung wurde überwunden, als Gordon et al. Erzeugte die erste transgene Mauslinie durch Mikroinjektion 5 , 6 . Dies begann die Ära der rekombinanten DNA-Technologie, und die Parameter, die das Ergebnis einer Mikroinjektionssitzung beeinflussen, wurden weitgehend untersucht 7 . Obwohl die Mikroinjektion keine Kontrolle über die Integrationsstelle des Transgens erlaubt (was schließlich zu spezifischen Expressionsniveaus für jede Gründermaus führt) bleibt der Hauptvorteil der vorkernigen Mikroinjektion die Bildung von Concatemern ( dh Arrays von mehreren Kopien des Transgens, Verknüpft in Serie) vor der genomischen Integration 5 . Dieses Merkmal wurde im Laufe der Jahre verwendet, um Tausende von transgenen Mauslinien zu etablieren, die ein Gen von Interesse überexprimieren. Seitdem, transgenese, die aRtificiale Modifikation des Genoms eines Organismus wurde weitgehend verwendet, um die Rolle einzelner Gene beim Auftreten von Krankheiten zu identifizieren.

Eine weitere wichtige Errungenschaft bei der Manipulation des Mausgenoms wurde erreicht, als Mario Capecchi erfolgreich ein einziges Gen in der Maus unterbrach und die Ära des Gen-Targeting 8 öffnete. Allerdings traten grundsätzliche Nachteile schnell aus dem ES-zellbasierten Gen-Targeting hervor, einschließlich der Herausforderungen der Kultivierung von ES-Zellen, des etwas variablen Chimäritätsgrades und der Länge des Prozesses ( dh 12-18 Monate, minimal, um die Maus zu erhalten) .

In jüngster Zeit haben sich Fortschritte bei neuen Technologien wie z. B. konstruierte Endonukleasen ( z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALEN) und gruppierten regelmäßig zusammengesetzten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR / Cas9) als alternative Methoden ergeben Beschleunigen den Prozess der Gen-Targeting in micE 9 , 10 Diese Endonukleasen können durch Mikroinjektion leicht in Mausozyten injiziert werden, was die Erzeugung von Gen-gezielten Mäusen in nur 6 Wochen ermöglicht.

Seit dem ersten Bericht über die Verwendung von CRISPR für die Genombearbeitung 11 hat dieses bakterielle adaptive Immunsystem ZFN und TALEN aufgrund seiner vielen Vorteile, einschließlich der Leichtigkeit der Synthese und der Fähigkeit, mehrere Loci auf einmal (als "Multiplexing" bezeichnet) ersetzt "). CRISPR wurde zuerst für Gen-Targeting in Mäusen 12 verwendet und ist seitdem auf unzählige Arten angewendet worden, von Pflanzen auf Menschen 13 , 14 . Bisher gibt es keinen Bericht über eine einzige Art, die gegen CRISPR-Genom-Bearbeitung resistent ist.

Die beiden Hauptbegrenzungsschritte der Erzeugung von transgenen Mäusen sind die Injektion von Oozyten und die ReimplantationDieser Oozyten zu pseudo-schwangeren Frauen. Obwohl diese Technik von uns 15 und anderen 16 beschrieben worden ist, haben die jüngsten technischen Verbesserungen bei der Mausembryologie und den Gentransfertechniken den Prozess der Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen revolutioniert. Diese Verbesserungen werden hier beschrieben.

Protocol

Alle Verfahren wurden von der University of New South Wales Animals Care und Ethics Committee genehmigt. 1. Vorbereitung des Transgens (Random Integration) Analytische Agarose-Gelelektrophorese. Das Plasmid wird unter Verwendung geeigneter Enzyme (1 h Inkubation) oder Fast-Digest-Enzymen (15 bis 30 min Inkubation) in einem Thermocycler nach den Empfehlungen des Herstellers untersucht (siehe Abbildung 2A und seine Legende). </…

Representative Results

Im Folgenden werden die Arbeitsabläufe für die Mikroinjektion im Falle der zufälligen Integration und des CRISPR-vermittelten Gen-Targeting beschrieben (Abbildung 1 ). Abbildung 1: Typischer Workflow zur Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen. Für die zufällige Integration wird…

Discussion

Kritische Schritte im Protokoll

Die Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen ist technisch anspruchsvoll. Allerdings ist das hier vorgestellte Protokoll eine optimierte und vereinfachte Methode, die es ermöglicht, die Technik in Rekordzeit zu beherrschen und zu beheben. Für den erfolgreichen Abschluss der Technik sind zwei Schritte erforderlich. Zuerst kann die Synthese von linearen DNA-Matrizen (für die Synthese von sgRNAs) ohne Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) erreicht werden. Es …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Mitarbeitern der Tierfabrik (BRC) für ihre laufende Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom National Health and Medical Research Council und dem Australian Research Council finanziert.

Materials

Micropipette 0.1-2.5 ul Eppendorf 4920000016
Micropipette 2-20 ul Eppendorf 4920000040
Micropipette 20-200 ul Eppendorf 4920000067
Micropipette 100-1000 ul Eppendorf 4920000083
Molecular weight marker  Bioline BIO-33025 HyperLadder 1kb
Molecular weight marker  Bioline BIO-33056 HyperLadder 100 bp
Agarose Bioline BIO-41025
EDTA buffer Sigma-Aldrich 93296 10x – Dilute to 1x
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
SYBR Safe gel stain Invitrogen S33102
Gel extraction kit Qiagen 28706
PCR purification kit (Qiaquick) Qiagen 28106
Vacuum system (Manifold) Promega A7231
Nuclease-free microinjection buffer  Millipore MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter  Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNA Sigma-Aldrich CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330) Addgene 42230
Nuclease free water Sigma-Aldrich W4502
Phusion polymerase New England Biolabs M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit New England Biolabs E2050S
RNA purification spin columns (NucAway) Thermo Fisher Scientific AM10070
ssOligos Sigma-Aldrich OLIGO STANDARD
Donor plasmid Thermo Fisher Scientific GeneArt
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
KSOMaa embryo culture medium Zenith Biotech  ZEKS-100
Mineral oil Zenith Biotech  ZSCO-100
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Mouthpiece Sigma-Aldrich A5177
Glass microcapillaries Sutter Instrument BF100-78-10
Proteinase K Applichem A3830.0100
Dumont #5 forceps Fine Science Tools  91150-20
Iris scissors Fine Science Tools  91460-11
Vessel clamp Fine Science Tools  18374-43
Wound clips  Fine Science Tools  12040-01
Clips applier  Fine Science Tools  12018-12
Micro-scissors  Fine Science Tools  15000-03
Cauterizer Fine Science Tools  18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) Ethicon 1691H
5% CO2 incubator MG Scientific Galaxy 14S
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c
Thermocycler Eppendorf 6321 000.515
Electrophoresis set up BioRad 1640300
UV Transilluminator BioRad 1708110EDU
Thermocycler Eppendorf 6334000069
Stereoscopic microscope Olympus SZX7
Inverted microscope Olympus IX71
2x Micromanipulators Eppendorf 5188000.012
Oocytes manipulator Eppendorf 5176000.025
Microinjector (Femtojet) Eppendorf 5247000.013
Mice C57BL/6J strain Australian BioResources C57BL/6JAusb 

References

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Cite This Article
Delerue, F., Ittner, L. M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes. J. Vis. Exp. (124), e55765, doi:10.3791/55765 (2017).

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